GH 후 성장판 마커로서의 miRNA

소개 재조합 인간 성장 호르몬(GH)의 치료적 사용에 대한 임상 경험은 각각의 승인된 적응증에 대해 치료받은 대부분의 환자에서 적절한 성장 반응을 발견했습니다. 그러나 다양한 치료 요법에 대한 경험이 축적됨에 따라 개별화된 치료 요법을 사용해도 개인의 1년차 키 반응이 상당히 다르다는 것이 인식되었습니다(1). 불량한 단기 반응은 또한 만족스럽지 못한 성인 키 증가로 이어집니다(2).

개별 환자의 성장 반응을 예측하기 위해 일부 수학적 모델이 개발되었습니다. 대규모 Pfizer International Growth Database(KIGS) 데이터베이스에서 파생된 예측 모델은 GHD 환자의 GH 요법에 대한 반응 가변성의 약 60%를 설명합니다(3). 이러한 모델은 응답성의 정의 가능한 가변성을 설명하여 임상의가 개별 환자에 대한 GH 용량을 조정할 수 있도록 합니다. 다중 회귀 분석을 기반으로 이 모델은 성장(주로 첫 해의 성장 속도)과 상관 관계가 있는 요인을 식별했습니다. 예를 들어 생활 연령, 도발 테스트 중 GH 피크, GH 용량, 출생 시 체중 SDS, 목표 키 SDS에 맞게 조정된 키 SDS 등이 있습니다. 삼). 기준선 IGF-I 및 렙틴과 같은 생화학적 변수도 예측 모델에 추가되었습니다.

엑손 3-결실 성장 호르몬 수용체 다형성, IGFBP3 다형성 및 기타와 같이 GH 치료에 대한 좋은 반응자와 나쁜 반응자를 구별하기 위한 유전적 마커도 사용되었지만, 그 결과는 다른 연구에서 모순되었습니다.

MicroRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 작은 비암호화 RNA입니다. 인간 게놈의 대부분의 유전자는 하나 이상의 miRNA에 의해 조절됩니다(4). 유전자 발현을 조절하는 능력으로 인해 miRNA는 인간 질병뿐만 아니라 병태생리학 및 생리학적 과정의 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 보입니다(5). MicroRNA는 일반적으로 mRNA의 3'UTR 도메인에 결합하여 유전자 발현을 억제하므로(6), mRNA 분해를 증가시키거나 번역 정보 및 단백질 합성을 방지합니다.

miRNA의 주목할만한 특징 중 하나는 엑소좀 내부의 혈장 순환으로 분해에 대한 저항성을 결정하고 순환하는 혈액에서 측정할 수 있으며 액체 생검으로 수행됩니다(7).

다양한 체외 모델과 동물에서의 과학적 증거는 miRNA가 연골 내 골화의 조절과 시상하부-뇌하수체-IGF 축의 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 시사했습니다(8). 특히 miRNA-140, 322 및 22는 성장판 발달을 담당하는 것으로 설명되었습니다(9). Catellani 등은 miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p 및 miR -494-3p는 WNT-βcatenin, Notch, PI3K/AKT 및 TGFβ 신호 경로에 대한 작용을 통해 세로 성장 및 뼈 발달의 조절에 관여합니다(10).

GH 치료 중 환자의 성장 반응은 환자의 기저 상태와 치료에 대한 개인의 선천적 감수성에 따라 다양합니다(11). 종종 측정된 성장 속도는 예상 속도와 일치하지 않으며 임상-기능적 매개변수와 용량 및 GH 피크 사이의 상관 정도는 치료 중 개인 간 및 개인 내에서 엄청나게 다양합니다(12).

따라서 본 연구의 목적은 GH 치료 전과 치료 중 순환 성장판 합성 miRNA를 측정하여 임상 및 생화학적 표지자와의 상관관계를 찾는 것이다.

방법 브라질 Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo의 Pediatric Endocrinology Unit에서 GH 결핍(GHD)을 동반한 두 성별의 어린이 및 청소년(n:30명의 환자)을 검사합니다. 서면 동의서는 모든 참가자와 그 부모로부터 적절하게 얻을 것입니다.

포함 기준: 뇌하수체 후엽 이소성 샘(EPP)을 보여주는 자기 공명 영상과 조합된 GH 피크 농도 <5ng/ml를 나타내는 GH 자극 시험. 복합 호르몬 결핍 환자는 연구 기간 동안 보상을 받아야 합니다.

제외 기준: 만성 질환, 글루코코르티코이드의 연장된 초생리학적 용량의 필요성, 골 연령 >14세 또는 >16세(각각 여아 및 남아), 연구 프로토콜 동안 적절한 후속 조치가 누락된 환자.

임상 후속 조치: 각 방문의 임상 기록에는 연령, 체중, 신장, 목표 신장 차이 및 사춘기 단계에 대한 신장이 포함됩니다. 임상 평가는 치료 시작 전(기초), GH 치료 중 1, 3, 6개월 후의 5가지 시점에서 이루어집니다. 체질량 지수(BMI)는 체중/키²(kg/m²)로 계산됩니다. 신장, 목표 신장(TH) 및 BMI는 SD 점수로 표현됩니다(WHO, 2007). 성장 속도 SDS는 Tanner 참조(13)를 사용하여 계산됩니다. 모든 과목의 사춘기는 Marshall과 Tanner의 기준(14, 15)에 따라 분류됩니다. 골연령은 6개월마다 구하여 Greulich와 Pyle(16)에 따라 분류하였다.

실험실 평가: 호르몬 측정은 3개월 및 6개월에 측정되며 IGF-I, 공복 혈당, 인슐린, TSH 및 유리 T4가 포함됩니다. 그리고 코티솔. 성선 자극 호르몬과 성 스테로이드는 적절할 때 측정됩니다. 성장판 합성 miRNA의 발현을 평가하기 위해 기본 혈액 샘플은 GH 요법을 시작하기 전 또는 단기 휴약 기간(15-30일) 후 및 GH 치료 중 1, 3 및 6개월 후에 채취됩니다.

MiRNA 결정: 정량적 PCR(qPCR)은 순환하는 miRNA 수준을 측정하는 데 사용됩니다. 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 액체 생검 응용 분야에서 황금 표준으로 간주됩니다. 저농도의 표적 핵산 분자를 검출하면서 내부/외부 정규화가 필요하지 않습니다. 전혈 샘플은 vacutainer 혈청 분리기 튜브에서 채취되고 수집 후 2시간 이내에 처리되며 4°C에서 10분 동안 2,000g에서 원심분리됩니다. 혈청은 1.5ml 멸균 RNase-free 튜브에 분주하고 오염 세포와 파편을 제거하기 위해 4°C에서 10분 동안 2,500g에서 추가로 원심분리합니다. 혈청은 무균 RNase-free 튜브에 수집하여 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit(ID: 217204 - Qiagen)를 사용하여 200ul 혈청을 사용하여 샘플에서 총 RNA를 분리합니다.

다음 miRNA가 측정됩니다: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p 및 miR-494-3p. 각 ddPCR 분석에 대해 3μL cDNA 샘플, 프로브용 10μL 2x ddPCR 슈퍼믹스(Bio-Rad), 1μL 20x TaqMan miRNA 프로브 및 6μL RNase-free Water가 20μL 반응 혼합물에 추가됩니다. 그런 다음 혼합물과 70μL 프로브용 액적 생성 오일(Bio-Rad)을 일회용 액적 생성 카트리지(Bio-Rad)의 샘플 웰과 오일 웰에 각각 로드합니다. 그 후 QX200 액적 생성 장치(Bio-Rad)에서 액적을 생성하고 조심스럽게 96웰 PCR 플레이트(Eppendorf)로 옮깁니다. 순환 조건은 95°C에서 10분, 95°C에서 15초, 57°C에서 1분 동안 40회, 최종 단계는 98°C에서 10분 동안입니다. PCR 반응이 끝나면 QX200 액적 판독기에서 액적을 읽고 Quantasoft™ 버전 1.7.4 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 분석합니다.

이점: GH 반응성과 상관 관계가 있는 miRNA 패널을 설정하는 것은 임상 적용 가능성이 매우 높기 때문에 GH 치료 중 최상의 반응을 달성하기 위한 차등 치료 프로토콜이 필요한 환자를 신속하게 식별할 수 있습니다.