miRNA jako marker růstové destičky po GH

Úvod Klinické zkušenosti s terapeutickým použitím rekombinantního lidského růstového hormonu (GH) nalezly u většiny pacientů léčených pro každou ze schválených indikací adekvátní růstovou odpověď. Jak se však zkušenosti s různými léčebnými režimy hromadí, bylo zjištěno, že individuální výškové odpovědi v prvním roce se značně liší i při individualizovaných léčebných režimech (1). Špatná krátkodobá reakce se také promítá do neuspokojivého nárůstu výšky v dospělosti (2).

Některé matematické modely byly vyvinuty za účelem predikce růstové reakce jednotlivých pacientů. Predikční modely odvozené z velké databáze Pfizer International Growth Database (KIGS) vysvětlují přibližně 60 % variability odpovědi na terapii růstovým hormonem u pacientů s GHD (3). Tyto modely zohledňují definovatelnou variabilitu odezvy, což umožňuje lékařům upravit dávku GH pro jednotlivého pacienta. Na základě vícenásobných regresních analýz tyto modely identifikovaly faktory, které korelují s růstem (hlavně rychlost růstu prvního roku), jako je chronologický věk, vrchol GH během provokativních testů, dávka GH, SDS porodní hmotnosti, SDS výšky upravené pro cílovou výšku SDS ( 3). Do predikčních modelů byly také přidány biochemické proměnné, jako je výchozí IGF-I a leptin.

Genetické markery byly také použity ve snaze rozlišit dobré a špatné reagující na léčbu GH, jako je polymorfismus receptoru růstového hormonu s deletovaným exonem 3, polymorfismus IGFBP3 a další, ale jejich výsledky byly v různých studiích protichůdné.

MikroRNA (miRNA) jsou malé nekódující RNA, které regulují genovou expresi. Většina genů v lidském genomu je regulována jednou nebo více miRNA (4). Zdá se, že miRNA hrají díky své schopnosti regulovat genovou expresi důležitou roli v patofyziologii a vývoji fyziologických procesů a také u lidských onemocnění (5). MikroRNA obvykle potlačují genovou expresi vazbou na doménu 3'UTR mRNA (6), čímž zvyšují degradaci mRNA nebo brání translační informaci a syntéze proteinů.

Jednou z pozoruhodných charakteristik miRNA je cirkulace plazmy uvnitř exozomů, určující její odolnost vůči degradaci, umožňující její měření v cirkulující krvi, fungující jako tekutá biopsie (7).

Vědecké důkazy na různých modelech in vitro a u zvířat naznačují, že miRNA hrají důležitou roli v regulaci endochondrální osifikace a v regulaci osy hypotalamus-hypofýza-IGF (8). Zejména miRNA-140, 322 a 22 byly popsány jako zodpovědné za vývoj růstových ploten (9). Catellani et al ukázali, že miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p a miR -494-3p se podílejí na regulaci podélného růstu a vývoje kostí prostřednictvím svého působení na signální dráhy WNT-βcatenin, Notch, PI3K/AKT a TGFβ (10).

Růstová odpověď u pacientů během léčby GH je variabilní, závisí jak na bazálních stavech pacienta, tak na individuální vrozené citlivosti na terapii (11). Naměřená rychlost růstu se často neshoduje s očekávanou a míra korelace mezi klinicko-auxologickými parametry a dávkou a vrcholem GH se během léčby enormně liší, a to jak inter, tak intraindividuálně (12).

Cílem této studie je proto změřit miRNA syntetizované cirkulující růstovou ploténkou před a během léčby GH a hledat jejich korelaci s klinickými a biochemickými markery.

Metody Děti a dospívající (n:30 pacientů), obou pohlaví, s nedostatkem GH (GHD) sledováni na dětské endokrinologické jednotce Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brazílie, budou vyšetřeni. Od všech účastníků a případně jejich rodičů bude získán písemný informovaný souhlas.

Kritéria pro zařazení: Stimulační test GH ukazující maximální koncentraci GH <5 ng/ml v kombinaci se zobrazením magnetickou rezonancí ukazující ektopickou žlázu zadní hypofýzy (EPP). Pacientky s kombinovaným hormonálním deficitem musí být v průběhu studie kompenzovány.

Kritéria vyloučení: chronická onemocnění, potřeba prodloužených suprafyziologických dávek glukokortikoidů, kostní věk >14 let nebo >16 let (dívky a chlapci), pacienti postrádající adekvátní sledování během protokolu studie.

Klinické sledování: Klinické záznamy při každé návštěvě budou zahrnovat věk, hmotnost, výšku, rozdíl od výšky k cílové výšce a pubertální fázi. Klinické hodnocení bude provedeno v pěti časových bodech: před zahájením léčby (bazální) a po 1, 3 a 6 měsících během léčby GH. Index tělesné hmotnosti (BMI) se vypočítá jako hmotnost/výška² (kg/m²). Výška, cílová výška (TH) a BMI budou vyjádřeny jako SD skóre (WHO, 2007). SDS rychlosti růstu bude vypočítána pomocí Tannerovy reference (13). Puberta u všech subjektů bude klasifikována podle kritérií Marshalla a Tannera (14, 15). Kostní věk byl zjišťován každých 6 měsíců a klasifikován podle Greulicha a Pylea (16).

Laboratorní hodnocení: Měření hormonů bude měřeno ve 3. a 6. měsíci a bude zahrnovat IGF-I, glukózu nalačno, inzulín, TSH a volný T4; a kortizolu. V případě potřeby budou měřeny gonadotropiny a pohlavní steroidy. K vyhodnocení exprese miRNA syntetizovaných růstovou ploténkou bude odebrán vzorek bazální krve před zahájením terapie GH nebo po krátkodobém vymývacím období (15–30 dní) a po 1, 3 a 6 měsících během léčby GH.

Stanovení miRNA: kvantitativní PCR (qPCR) bude použita k měření hladin cirkulující miRNA pomocí kapkové digitální PCR (ddPCR), která je považována za zlatý standard při aplikaci tekuté biopsie, protože její vynikající přesnost a citlivost je méně ovlivněna PCR inhibitory a nevyžadují vnitřní/externí normalizaci při detekci nízké koncentrace molekul cílových nukleových kyselin. Vzorek plné krve bude odebrán do zkumavek se separátorem séra Vacutainer a zpracován do 2 hodin od odběru, centrifugován při 2 000 g po dobu 10 minut při 4 °C. Sérum bude rozděleno na alikvoty do 1,5 ml sterilních zkumavek bez RNázy a dále centrifugováno při 2 500 g po dobu 10 minut při 4 °C, aby se odstranily všechny kontaminující buňky a zbytky. Sérum bude odebíráno do sterilních zkumavek bez RNázy a skladováno při -80 °C až do použití. Celková RNA bude izolována ze vzorku pomocí 200 ul séra pomocí miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (ID: 217204 - Qiagen).

Budou měřeny následující miRNA: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p a miR-494-3p. Pro každý test ddPCR budou přidány 3 μl vzorku cDNA, 10 μl 2× ddPCR supermix pro sondy (Bio-Rad), 1 μl 20× TaqMan miRNA sondy a 6 μl vody bez RNázy v 20 μL reakční směsi. Poté se směs a 70 μl oleje pro tvorbu kapek pro sondy (Bio-Rad) vloží do jamek pro vzorky a olejových jamek jednorázové kazety s generátorem kapek (Bio-Rad). Poté budou kapky generovány zařízením pro generátor kapiček QX200 (Bio-Rad) a opatrně přeneseny na 96-jamkovou PCR destičku (Eppendorf). Podmínky cyklování budou: 95 °C po dobu 10 minut, 40 cyklů při 95 °C po dobu 15 s a 57 °C po dobu 1 minuty a závěrečný krok při 98 °C po dobu 10 minut. Na konci PCR reakce budou kapky odečteny ve čtečce kapek QX200 a analyzovány pomocí softwaru Quantasoft™ verze 1.7.4 (Bio-Rad).

Výhody: Sestavení panelu miRNA, který koreluje s odezvou GH, má obrovskou klinickou použitelnost a umožňuje rychlou identifikaci pacientů, kteří potřebují různé terapeutické protokoly zaměřené na dosažení nejlepší odpovědi během léčby GH.