miARN comme marqueur de plaque de croissance après GH

Introduction L'expérience clinique avec l'utilisation thérapeutique de l'hormone de croissance humaine recombinante (GH) a trouvé une réponse de croissance adéquate chez la majorité des patients traités pour chacune des indications approuvées. Cependant, à mesure que l'expérience s'accumule avec différents schémas thérapeutiques, il a été reconnu que les réponses individuelles à la taille de la première année varient considérablement même avec des schémas thérapeutiques individualisés (1). Une mauvaise réponse à court terme se traduit également par un gain de taille adulte insatisfaisant (2).

Certains modèles mathématiques ont été développés afin de prédire la réponse de croissance d'un patient individuel. Les modèles de prédiction dérivés de la grande base de données Pfizer International Growth Database (KIGS) expliquent environ 60 % de la variabilité de la réponse au traitement par GH chez les patients atteints de GHD (3). De tels modèles tiennent compte de la variabilité définissable de la réactivité, permettant aux cliniciens d'ajuster la dose de GH à chaque patient. Sur la base d'analyses de régression multiples, ces modèles ont identifié des facteurs en corrélation avec la croissance (principalement la vitesse de croissance de la première année), tels que l'âge chronologique, le pic de GH lors des tests de provocation, la dose de GH, le poids à la naissance SDS, la taille SDS ajustée pour la taille cible SDS ( 3). Des variables biochimiques telles que l'IGF-I de base et la leptine ont également été ajoutées aux modèles de prédiction.

Des marqueurs génétiques ont également été utilisés pour tenter de discriminer les bons et les mauvais répondeurs au traitement à la GH, comme le polymorphisme du récepteur de l'hormone de croissance avec suppression de l'exon 3, le polymorphisme IGFBP3 et autres, mais leurs résultats étaient contradictoires dans les différentes études.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui régulent l'expression des gènes. La plupart des gènes du génome humain sont régulés par un ou plusieurs miARN (4). En raison de leur capacité à réguler l'expression des gènes, les miARN semblent jouer un rôle important dans la physiopathologie et le développement des processus physiologiques, ainsi que dans les maladies humaines (5). Les microARN suppriment généralement l'expression des gènes en se liant au domaine 3'UTR de l'ARNm (6), augmentant ainsi la dégradation de l'ARNm ou empêchant la synthèse des informations de traduction et des protéines.

L'une des caractéristiques remarquables des miARN est la circulation plasmatique à l'intérieur des exosomes, déterminant sa résistance à la dégradation, permettant sa mesure dans le sang circulant, fonctionnant comme une biopsie liquide (7).

Des preuves scientifiques dans différents modèles in vitro et chez l'animal suggèrent que les miARN jouent un rôle important dans la régulation de l'ossification endochondrale et dans la régulation de l'axe hypothalamo-hypophysaire-IGF (8). En particulier, les miARN-140, 322 et 22 ont été décrits comme responsables du développement des plaques de croissance (9). Catellani et al, ont montré que miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340- 5p et miR -494-3p sont impliqués dans la régulation de la croissance longitudinale et du développement osseux, par son action sur les voies de signalisation WNT-βcaténine, Notch, PI3K/AKT et TGFβ (10).

La réponse de croissance chez les patients pendant le traitement par GH est variable, en fonction à la fois des conditions basales du patient et de la sensibilité innée individuelle au traitement (11). Souvent, le taux de croissance mesuré ne coïncide pas avec celui attendu et le degré de corrélation entre les paramètres clinico-auxologiques et la dose et le pic de GH varient énormément, à la fois inter et intra-individuellement au cours du traitement (12).

Par conséquent, le but de cette étude est de mesurer les miARN synthétisés sur la plaque de croissance circulante avant et pendant le traitement à la GH, en recherchant sa corrélation avec des marqueurs cliniques et biochimiques.

Méthodes Les enfants et les adolescents (n : 30 patients), des deux sexes, présentant un déficit en GH (GHD) suivis à l'unité d'endocrinologie pédiatrique de l'Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brésil, seront dépistés. Un consentement éclairé écrit sera obtenu de tous les participants et de leurs parents, le cas échéant.

Critères d'inclusion : test de stimulation de la GH montrant une concentration maximale de GH <5 ng/ml, combinée à une imagerie par résonance magnétique montrant la glande ectopique hypophysaire postérieure (PPE). Les patients présentant des déficits hormonaux combinés doivent être indemnisés pendant la période d'étude.

Critères d'exclusion : maladies chroniques, besoin de doses supraphysiologiques prolongées de glucocorticoïdes, âge osseux > 14 ans ou > 16 ans (filles et garçons, respectivement), patients manquant un suivi adéquat pendant le protocole d'étude.

Suivi clinique : Les dossiers cliniques à chaque visite comprendront l'âge, le poids, la taille, la différence entre la taille et la taille cible et le stade pubertaire. L'évaluation clinique sera effectuée à cinq moments : avant le début du traitement (basal) et après 1, 3 et 6 mois pendant le traitement à la GH. L'indice de masse corporelle (IMC) sera calculé en poids/taille² (kg/m²). La taille, la taille cible (TH) et l'IMC seront exprimés sous forme de score SD (OMS, 2007). La vitesse de croissance SDS sera calculée en utilisant la référence de Tanner (13). La puberté chez tous les sujets sera classée selon les critères de Marshall et Tanner (14, 15). L'âge osseux sera obtenu tous les 6 mois et classé selon Greulich et Pyle (16).

Évaluation en laboratoire : les mesures hormonales seront mesurées à 3 et 6 mois et comprendront l'IGF-I, la glycémie à jeun, l'insuline, la TSH et la T4 libre ; et le cortisol. Les gonadotrophines et les stéroïdes sexuels seront mesurés si nécessaire. Pour évaluer l'expression des miARN synthétisés sur la plaque de croissance, un échantillon de sang basal sera obtenu avant de commencer le traitement à la GH ou après une courte période de sevrage (15 à 30 jours) et après 1, 3 et 6 mois pendant le traitement à la GH.

Détermination des miARN : la PCR quantitative (qPCR) sera utilisée pour mesurer les niveaux de miARN circulants, en utilisant la PCR numérique en gouttelettes (ddPCR), considérée comme la référence dans l'application de la biopsie liquide, car sa précision et sa sensibilité supérieures sont moins affectées par des inhibiteurs de PCR, et ne nécessitent pas de normalisation interne/externe tout en détectant une faible concentration de molécules d'acides nucléiques cibles. Un échantillon de sang total sera prélevé dans des tubes séparateurs de sérum Vacutainer et traité dans les 2 heures suivant le prélèvement, centrifugé à 2 000 g pendant 10 min à 4 °C. Le sérum sera aliquoté dans des tubes stériles sans RNase de 1,5 ml et centrifugé à 2 500 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les cellules contaminantes et les débris. Le sérum sera recueilli dans des tubes stériles sans RNase et conservé à -80 °C jusqu'à son utilisation. L'ARN total sera isolé de l'échantillon à l'aide de 200 ul de sérum à l'aide du kit avancé miRNeasy Serum/Plasma (ID : 217204 - Qiagen).

Les miARN suivants seront mesurés : miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p et miR-494-3p. Pour chaque test ddPCR, 3 μL d'échantillon d'ADNc, 10 μL de supermix ddPCR 2× pour sondes (Bio-Rad), 1 μL de sonde miARN 20× TaqMan et 6 μL d'eau sans RNase seront ajoutés dans un mélange réactionnel de 20 μL. Ensuite, le mélange et 70 μL d'huile de génération de gouttelettes pour sondes (Bio-Rad) seront respectivement chargés dans les puits d'échantillon et les puits d'huile d'une cartouche jetable de générateur de gouttelettes (Bio-Rad). Après cela, les gouttelettes seront générées par le dispositif générateur de gouttelettes QX200 (Bio-Rad) et soigneusement transférées sur une plaque PCR à 96 puits (Eppendorf). Les conditions de cyclage seront : 95 °C pendant 10 min, 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 57 °C pendant 1 min, et une étape finale à 98 °C pendant 10 min. A la fin de la réaction PCR, les gouttelettes seront lues dans le lecteur de gouttelettes QX200 et analysées à l'aide du logiciel Quantasoft™ version 1.7.4 (Bio-Rad).

Avantages : L'établissement d'un panel de miARN corrélés à la réactivité de la GH est d'une grande applicabilité clinique, permettant une identification rapide des patients qui ont besoin de protocoles thérapeutiques différentiels ciblés pour obtenir la meilleure réponse pendant le traitement à la GH.