miRNA come marcatore della piastra di crescita dopo GH

Introduzione L'esperienza clinica con l'uso terapeutico dell'ormone della crescita umano (GH) ricombinante ha riscontrato un'adeguata risposta di crescita nella maggior parte dei pazienti trattati per ciascuna delle indicazioni approvate. Tuttavia, poiché l'esperienza si accumula con diversi regimi di trattamento, è stato riconosciuto che le risposte individuali relative all'altezza del primo anno variano considerevolmente anche con regimi di trattamento individualizzati (1). Una scarsa risposta a breve termine si traduce anche in un aumento insoddisfacente dell'altezza degli adulti (2).

Sono stati sviluppati alcuni modelli matematici per prevedere la risposta di crescita di un singolo paziente. I modelli di previsione derivati ​​dal grande database Pfizer International Growth Database (KIGS) spiegano circa il 60% della variabilità della risposta alla terapia con GH nei pazienti con GHD (3). Tali modelli tengono conto della variabilità definibile della risposta, consentendo ai medici di adattare la dose di GH al singolo paziente. Sulla base di analisi di regressione multipla, questi modelli hanno identificato i fattori correlati alla crescita (principalmente la velocità di crescita del primo anno), come l'età cronologica, il picco di GH durante i test di provocazione, la dose di GH, il peso alla nascita SDS, l'altezza SDS aggiustata per l'altezza target ( 3). Ai modelli di previsione sono state aggiunte anche variabili biochimiche come l'IGF-I di base e la leptina.

I marcatori genetici sono stati utilizzati anche nel tentativo di discriminare i buoni e i cattivi responsivi al trattamento con GH, come il polimorfismo del recettore dell'ormone della crescita eliminato dall'esone 3, il polimorfismo IGFBP3 e altri, ma i loro risultati sono stati contraddittori nei diversi studi.

I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione genica. La maggior parte dei geni nel genoma umano sono regolati da uno o più miRNA (4). Grazie alla loro capacità di regolare l'espressione genica, i miRNA sembrano svolgere un ruolo importante nella fisiopatologia e nello sviluppo dei processi fisiologici, così come nelle malattie umane (5). I microRNA di solito sopprimono l'espressione genica legandosi al dominio 3'UTR dell'mRNA (6), aumentando quindi la degradazione dell'mRNA o impedendo l'informazione traduzionale e la sintesi proteica.

Una delle caratteristiche notevoli dei miRNA è la circolazione del plasma all'interno degli esosomi, determinandone la resistenza alla degradazione, permettendone la misurazione nel sangue circolante, che si comporta come una biopsia liquida (7).

Prove scientifiche in diversi modelli in vitro e negli animali, hanno suggerito che i miRNA hanno un ruolo importante nella regolazione dell'ossificazione endocondrale e nella regolazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-IGF (8). In particolare, i miRNA-140, 322 e 22 sono stati descritti come responsabili dello sviluppo della cartilagine di accrescimento (9). Catellani et al, hanno dimostrato che miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p e miR -494-3p è coinvolto nella regolazione della crescita longitudinale e dello sviluppo osseo, attraverso la sua azione sulle vie di segnalazione WNT-βcatenina, Notch, PI3K/AKT e TGFβ (10).

La risposta di crescita nei pazienti durante il trattamento con GH è variabile, a seconda sia delle condizioni basali del paziente che della sensibilità innata individuale alla terapia (11). Spesso il tasso di crescita misurato non coincide con quello atteso e il grado di correlazione tra parametri clinico-auxologici e dose e picco di GH varia enormemente, sia inter sia intra-individualmente durante il trattamento (12).

Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di misurare i miRNA sintetizzati nella piastra di crescita circolante prima e durante il trattamento con GH, cercando la sua correlazione con marcatori clinici e biochimici.

Metodi Verranno sottoposti a screening bambini e adolescenti (n:30 pazienti), di entrambi i sessi, con deficit di GH (GHD) seguiti presso l'Unità di Endocrinologia Pediatrica dell'Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brasile. Il consenso informato scritto sarà ottenuto da tutti i partecipanti e dai loro genitori, a seconda dei casi.

Criteri di inclusione: test di stimolazione del GH che mostra una concentrazione di picco di GH <5 ng/ml, combinato con imaging a risonanza magnetica che mostra la ghiandola ectopica dell'ipofisi posteriore (EPP). I pazienti con deficit ormonali combinati devono essere compensati durante il periodo di studio.

Criteri di esclusione: malattie croniche, necessità di dosi soprafisiologiche prolungate di glucocorticoidi, età ossea >14 anni o >16 anni (ragazze e ragazzi, rispettivamente), pazienti che non hanno ricevuto un adeguato follow-up durante il protocollo di studio.

Follow-up clinico: le cartelle cliniche ad ogni visita includeranno età, peso, altezza, altezza rispetto alla differenza di altezza target e stadio puberale. La valutazione clinica verrà effettuata in cinque punti temporali: prima di iniziare la terapia (basale) e dopo 1, 3 e 6 mesi durante il trattamento con GH. L'indice di massa corporea (BMI) sarà calcolato come peso/altezza² (kg/m²). Altezza, altezza target (TH) e BMI saranno espressi come punteggio SD (WHO, 2007). La velocità di crescita SDS sarà calcolata utilizzando il riferimento di Tanner (13). La pubertà in tutti i soggetti sarà classificata secondo i criteri di Marshall e Tanner (14, 15). L'età ossea sarà ottenuta ogni 6 mesi e classificata secondo Greulich e Pyle (16).

Valutazione di laboratorio: le misurazioni degli ormoni saranno misurate a 3 e 6 mesi e includeranno IGF-I, glucosio a digiuno, insulina, TSH e T4 libero; e cortisolo. Le gonadotropine e gli steroidi sessuali saranno misurati quando adeguati. Per valutare l'espressione dei miRNA sintetizzati nella piastra di crescita, verrà prelevato un campione di sangue basale prima di iniziare la terapia con GH o dopo un breve periodo di washout (15-30 giorni) e dopo 1, 3 e 6 mesi durante il trattamento con GH.

Determinazione dei miRNA: la PCR quantitativa (qPCR) verrà utilizzata per misurare i livelli di miRNA circolanti, impiegando la PCR digitale a goccioline (ddPCR), considerata il gold standard nell'applicazione della biopsia liquida, a causa della sua precisione e sensibilità superiori, essendo meno influenzata dagli inibitori della PCR e non richiedono normalizzazione interna/esterna durante il rilevamento di basse concentrazioni di molecole di acidi nucleici bersaglio. Un campione di sangue intero sarà prelevato in provette vacutainer con separatore di siero, processato entro 2h dal prelievo, centrifugato a 2000 g per 10 min a 4°C. Il siero sarà aliquotato in provette sterili prive di RNasi da 1,5 ml e ulteriormente centrifugato a 2.500 g per 10 minuti a 4°C per rimuovere eventuali cellule contaminanti e detriti. Il siero sarà raccolto in provette sterili prive di RNasi e conservato a -80°C fino al momento dell'uso. L'RNA totale sarà isolato dal campione utilizzando 200 ul di siero utilizzando il miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (ID: 217204 - Qiagen).

Saranno misurati i seguenti miRNA: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p e miR-494-3p. Per ogni analisi ddPCR, verranno aggiunti 3 μL di campione di cDNA, 10 μL 2 × ddPCR supermix per sonde (Bio-Rad), 1 μL 20 × TaqMan miRNA probe e 6 μL di acqua priva di RNasi in una miscela di reazione da 20 μL. Quindi, la miscela e 70 μL di olio per la generazione di goccioline per sonde (Bio-Rad) saranno rispettivamente caricati nei pozzetti del campione e nei pozzetti dell'olio di una cartuccia del generatore di goccioline usa e getta (Bio-Rad). Successivamente, le goccioline saranno generate dal dispositivo generatore di goccioline QX200 (Bio-Rad) e trasferite con cura su una piastra PCR a 96 pozzetti (Eppendorf). Le condizioni di ciclaggio saranno: 95 °C per 10 min, 40 cicli di 95 °C per 15 s e 57 °C per 1 min, e una fase finale a 98 °C per 10 min. Al termine della reazione PCR, le goccioline verranno lette nel lettore di goccioline QX200 e analizzate utilizzando il software Quantasoft™ versione 1.7.4 (Bio-Rad).

Vantaggi: stabilire un pannello di miRNA correlato alla reattività del GH è di enorme applicabilità clinica, consentendo una rapida identificazione dei pazienti che necessitano di protocolli terapeutici differenziali mirati a ottenere la migliore risposta durante il trattamento con GH.