miRNA 作为 GH 后的生长板标记

简介 重组人生长激素 (GH) 治疗用途的临床经验发现，大多数接受每种批准适应症治疗的患者都有足够的生长反应。 然而，随着不同治疗方案经验的积累，人们认识到，即使采用个体化治疗方案，个体第一年的身高反应也有很大差异(1)。 短期反应不佳也会导致成年身高增长不理想 (2)。

开发了一些数学模型来预测个体患者的生长反应。 来自大型辉瑞国际生长数据库 (KIGS) 数据库的预测模型解释了 GHD 患者对 GH 治疗反应的大约 60% 的变异性 (3)。 这些模型解释了反应性的可定义变异性，允许临床医生根据个体患者调整 GH 剂量。 基于多元回归分析，这些模型确定了与生长（主要是第一年生长速度）相关的因素，例如实际年龄、激发试验期间的 GH 峰值、GH 剂量、出生体重 SDS、根据目标身高 SDS 调整的身高 SDS（ 3）。 基线 IGF-I 和瘦素等生化变量也已添加到预测模型中。

遗传标记也被用来试图区分对 GH 治疗反应良好和不良的患者，如外显子 3 缺失的生长激素受体多态性、IGFBP3 多态性等，但在不同的研究中，它们的结果是矛盾的。

MicroRNA (miRNA) 是调节基因表达的小型非编码 RNA。 人类基因组中的大多数基因均受一种或多种 miRNA 调控 (4)。 由于其调节基因表达的能力，miRNA 似乎在病理生理学和生理过程的发展以及人类疾病中发挥着重要作用 (5)。 MicroRNA 通常通过与 mRNA 的 3'UTR 结构域结合来抑制基因表达 (6)，从而增加 mRNA 降解或阻止翻译信息和蛋白质合成。

miRNA 的显着特征之一是外泌体内部的血浆循环，决定了其对降解的抵抗力，允许其在循环血液中进行测量，就像液体活检一样 (7)。

不同体外模型和动物中的科学证据表明 miRNA 在软骨内骨化的调节和下丘脑-垂体-IGF 轴的调节中具有重要作用 (8)。 特别是，miRNA-140、322 和 22 被描述为负责生长板的发育 (9)。 Catellani 等人表明 miR-22-3p、miR-30c-5p、miR-106a-5p、miR-140-5p、miR-199a-5p、miR-335-5p、miR-340-5p 和 miR -494-3p 通过作用于 WNT-β 连环蛋白、Notch、PI3K/AKT 和 TGFβ 信号通路，参与纵向生长和骨发育的调节 (10)。

GH 治疗期间患者的生长反应是可变的，具体取决于患者的基础状况和个体对治疗的先天敏感性 (11)。 通常，测量的生长速率与预期的生长速率不一致，并且临床生长学参数与剂量和 GH 峰值之间的相关程度在治疗期间的个体间和个体内变化很大 (12)。

因此，本研究的目的是测量GH治疗前和治疗期间循环生长板合成的miRNA，寻找其与临床和生化标志物的相关性。

方法 将在巴西圣保罗 Irmandade da Santa Casa de Misericórdia 儿科内分泌科对患有 GH 缺乏症 (GHD) 的儿童和青少年（n：30 名性别患者）进行筛查。 将酌情从所有参与者及其父母处获得书面知情同意书。

纳入标准：GH 刺激测试显示 GH 峰值浓度 <5ng/ml，结合磁共振成像显示垂体后异位腺 (EPP)。 合并激素缺乏的患者必须在研究期间得到补偿。

排除标准：慢性疾病、需要长期超生理剂量的糖皮质激素、骨龄>14岁或>16岁（分别为女孩和男孩）、患者在研究方案期间缺少足够的随访。

临床随访：每次就诊的临床记录将包括年龄、体重、身高、身高与目标身高差以及青春期阶段。 临床评估将在五个时间点进行：开始治疗前（基础），以及 GH 治疗期间 1、3 和 6 个月后。 体重指数 (BMI) 将按体重/身高² (kg/m²) 计算。 身高、目标身高 (TH) 和 BMI 将表示为 SD 分数（WHO，2007）。 生长速度 SDS 将使用 Tanner 参考文献 (13) 计算。 所有科目的青春期都将按照 Marshall 和 Tanner 的标准进行分类 (14, 15)。 骨龄每 6 个月获得一次，并根据 Greulich 和 Pyle (16) 进行分类。

实验室评估：激素测量将在 3 个月和 6 个月时进行测量，包括 IGF-I、空腹血糖、胰岛素、TSH 和游离 T4；和皮质醇。 当足够时，将测量促性腺激素和性类固醇。 为了评估生长板合成的 miRNA 的表达，将在开始 GH 治疗之前或短期清洗期（15-30 天）后以及 GH 治疗期间 1、3 和 6 个月后获取基础血样。

miRNA测定：定量PCR（qPCR）将用于测量循环miRNA水平，采用微滴数字PCR（ddPCR），被认为是液体活检应用的金标准，因为其优越的精度和灵敏度，受到的影响较小通过PCR抑制剂，在检测低浓度的靶核酸分子时不需要内部/外部标准化。 全血样本将被抽取到真空采血管血清分离管中，并在收集后 2 小时内进行处理，在 4°C 下以 2,000 g 离心 10 分钟。 将血清等分到 1.5 ml 无菌无 RNase 管中，并在 4°C 下以 2,500 g 进一步离心 10 分钟，以去除任何污染细胞和碎片。 将血清收集在无菌的无 RNase 管中并储存在 -80°C 直至使用。 使用 miRNeasy 血清/血浆高级试剂盒（ID：217204 - Qiagen），使用 200 ul 血清从样品中分离总 RNA。

将测量以下 miRNA：miR-22-3p、miR-30c-5p、miR-106a-5p、miR-140-5p、miR-199a-5p、miR-335-5p、miR-340-5p 和miR-494-3p。 对于每个 ddPCR 测定，将 3 μL cDNA 样品、10 μL 2× ddPCR 探针超混合液 (Bio-Rad)、1 μL 20× TaqMan miRNA 探针和 6 μL 无 RNase 水添加到 20 μL 反应混合物中。 然后，将混合物和70μL探针用液滴发生油(Bio-Rad)分别装入一次性液滴发生盒(Bio-Rad)的样品孔和油井中。 之后，通过 QX200 液滴发生器装置 (Bio-Rad) 产生液滴，并小心地转移到 96 孔 PCR 板 (Eppendorf) 上。 循环条件为：95°C 10 分钟，95°C 15 秒和 57°C 1 分钟的 40 个循环，最后一步为 98°C 10 分钟。 PCR 反应结束时，将在 QX200 液滴读取器中读取液滴，并使用 Quantasoft™ 1.7.4 版软件 (Bio-Rad) 进行分析。

优点：建立一组与 GH 反应性相关的 miRNA 具有巨大的临床适用性，可以迅速识别需要差异化治疗方案的患者，以在 GH 治疗期间实现最佳反应。