miRNA kasvulevymarkkerina GH:n jälkeen

Johdanto Ihmisen rekombinantin kasvuhormonin (GH) terapeuttisesta käytöstä saatu kliininen kokemus on osoittanut riittävän kasvuvasteen suurimmalla osalla potilaista, joita on hoidettu kussakin hyväksytyssä käyttöaiheessa. Kokemuksen kertyessä erilaisista hoito-ohjelmista kuitenkin havaittiin, että yksilölliset ensimmäisen vuoden pituusvasteet vaihtelevat huomattavasti jopa yksilöllisillä hoito-ohjelmilla (1). Huono lyhytaikainen vaste muuttuu myös epätyydyttäväksi aikuisen pituuden nousuksi (2).

Joitakin matemaattisia malleja kehitettiin yksittäisten potilaiden kasvuvasteen ennustamiseksi. Suuresta Pfizer International Growth Database (KIGS) -tietokannasta johdetut ennustemallit selittävät noin 60 % GHD-potilaiden GH-hoidon vasteen vaihteluista (3). Tällaiset mallit ottavat huomioon määriteltävissä olevan vasteen vaihtelun, minkä ansiosta lääkärit voivat säätää GH-annosta yksittäisen potilaan mukaan. Useiden regressioanalyysien perusteella nämä mallit ovat tunnistaneet kasvun kanssa korreloivia tekijöitä (pääasiassa ensimmäisen vuoden kasvunopeuteen), kuten kronologinen ikä, GH-huippu provokatiivisten testien aikana, GH-annos, syntymäpainon SDS, pituuden SDS mukautettu tavoitepituuden SDS:lle ( 3). Ennustemalleihin on lisätty myös biokemiallisia muuttujia, kuten perustason IGF-I ja leptiini.

Geneettisiä markkereita käytettiin myös GH-hoitoon hyvien ja huonojen vasteiden erottamiseen, kuten eksonin 3-deletoitu kasvuhormonireseptoripolymorfismi, IGFBP3-polymorfismi ja muut, mutta niiden tulokset olivat eri tutkimuksissa ristiriitaisia.

MikroRNA:t (miRNA:t) ovat pieniä ei-koodaavia RNA:ita, jotka säätelevät geenien ilmentymistä. Useimpia ihmisen genomin geenejä säätelee yksi tai useampi miRNA (4). Koska miRNA:illa on kyky säädellä geenien ilmentymistä, niillä näyttää olevan tärkeä rooli fysiologisten prosessien patofysiologiassa ja kehityksessä sekä ihmisten sairauksissa (5). MikroRNA:t yleensä tukahduttavat geenin ilmentymistä sitoutumalla mRNA:n 3'UTR-domeeniin (6), mikä lisää mRNA:n hajoamista tai estää translaatioinformaatiota ja proteiinisynteesiä.

Yksi miRNA:iden merkittävistä ominaisuuksista on plasman kierto eksosomien sisällä, mikä määrittää sen vastustuskyvyn hajoamista vastaan, mahdollistaa sen mittaamisen kiertävässä veressä ja toimii nestemäisenä biopsiana (7).

Tieteelliset todisteet erilaisissa in vitro -malleissa ja eläimissä viittaavat siihen, että miRNA:illa on tärkeä rooli endokondraalisen luutumisen säätelyssä ja hypotalamus-aivolisäke-IGF-akselin säätelyssä (8). Erityisesti miRNA-140, 322 ja 22 on kuvattu vastuussa kasvulevyjen kehityksestä (9). Catellani ym., osoittivat, että miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p ja miR -494-3p osallistuvat pitkittäisen kasvun ja luun kehityksen säätelyyn WNT-βcatenin-, Notch-, PI3K/AKT- ja TGFp-signalointireitteihin kohdistuvan vaikutuksensa kautta (10).

Potilaiden kasvuvaste GH-hoidon aikana vaihtelee riippuen sekä potilaan perustiloista että yksilön synnynnäisestä herkkyydestä hoitoon (11). Usein mitattu kasvunopeus ei ole sama kuin odotettu kasvunopeus, ja kliinis-auksologisten parametrien sekä annoksen ja GH-huipun välinen korrelaatioaste vaihtelee valtavasti, sekä yksilöiden välillä että yksilöiden sisällä hoidon aikana (12).

Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena on mitata kiertävien kasvulevyjen syntetisoimia miRNA:ita ennen GH-hoitoa ja sen aikana etsimällä sen korrelaatiota kliinisten ja biokemiallisten markkerien kanssa.

Menetelmät Lapset ja nuoret (n:30 potilasta), molempia sukupuolia, joilla on kasvuhormonin puutos (GHD), joita seurataan lasten endokrinologian yksikössä Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulossa, Brasiliassa, seulotaan. Kaikilta osallistujilta ja heidän vanhemmiltaan hankitaan kirjallinen tietoinen suostumus tarpeen mukaan.

Osallistumiskriteerit: GH-stimulaatiotesti, joka osoittaa GH-huippupitoisuuden <5 ng/ml, yhdistettynä magneettikuvaukseen, joka osoittaa aivolisäkkeen ektooppisen rauhasen (EPP). Potilaat, joilla on yhdistetty hormonivajaus, on korvattava tutkimusjakson aikana.

Poissulkemiskriteerit: krooniset sairaudet, pitkittyneiden suprafysiologisten glukokortikoidiannosten tarve, luuston ikä > 14 vuotta tai > 16 vuotta (tytöt ja pojat, vastaavasti), potilaat, joilta puuttuu riittävä seuranta tutkimusprotokollan aikana.

Kliininen seuranta: Jokaisen käynnin kliiniset tiedot sisältävät iän, painon, pituuden, pituuden tavoitepituuseron ja murrosiän vaiheen. Kliininen arviointi suoritetaan viidessä ajankohtana: ennen hoidon aloittamista (perus) ja 1, 3 ja 6 kuukauden kuluttua GH-hoidon aikana. Painoindeksi (BMI) lasketaan painona/pituutena² (kg/m²). Pituus, tavoitepituus (TH) ja BMI ilmaistaan ​​SD-pisteinä (WHO, 2007). Kasvunopeuden SDS lasketaan käyttämällä Tanner-viittausta (13). Murrosikä kaikissa aiheissa luokitellaan Marshallin ja Tannerin kriteerien mukaisesti (14, 15). Luun ikä mitataan kuuden kuukauden välein ja luokitellaan Greulichin ja Pylen mukaan (16).

Laboratorioarviointi: Hormonimittaukset mitataan 3 ja 6 kuukauden iässä ja sisältävät IGF-I:n, paastoglukoosin, insuliinin, TSH:n ja vapaan T4:n; ja kortisoli. Gonadotropiinit ja sukupuolisteroidit mitataan, kun niitä on riittävästi. Kasvulevysyntetisoitujen miRNA:iden ilmentymisen arvioimiseksi otetaan perusverinäyte ennen GH-hoidon aloittamista tai lyhyen pesujakson (15-30 päivää) jälkeen ja 1, 3 ja 6 kuukauden kuluttua GH-hoidon aikana.

MiRNA:iden määritys: kvantitatiivista PCR:ää (qPCR) käytetään verenkierron miRNA-tasojen mittaamiseen käyttämällä pisara-digitaalista PCR:ää (ddPCR), jota pidetään kultastandardina nestebiopsian soveltamisessa, koska sen ylivoimainen tarkkuus ja herkkyys on vähäisempi. PCR-inhibiittorit, eivätkä vaadi sisäistä/ulkoista normalisointia, kun havaitaan kohdenukleiinihappomolekyylien alhainen pitoisuus. Kokoverinäyte otetaan vacutainer-seerumin erotinputkiin ja käsitellään 2 tunnin sisällä keräämisestä, sentrifugoidaan 2 000 g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa. Seerumi jaetaan eriin 1,5 ml:n steriileihin RNaasi-vapaisiin putkiin ja sentrifugoidaan edelleen 2 500 g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa mahdollisten kontaminanttisolujen ja roskien poistamiseksi. Seerumi kerätään steriileihin RNaasi-vapaisiin putkiin ja säilytetään -80 °C:ssa käyttöön asti. Kokonais-RNA eristetään näytteestä käyttämällä 200 ul:aa seerumia käyttämällä miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit -sarjaa (ID: 217204 - Qiagen).

Seuraavat miRNA:t mitataan: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p ja miR-494-3p. Jokaista ddPCR-määritystä varten 3 µl cDNA-näytettä, 10 µl 2× ddPCR-superseosta koettimille (Bio-Rad), 1 µl 20× TaqMan-miRNA-koetinta ja 6 µl RNaasi-vapaata vettä lisätään 20 µl:n reaktioseokseen. Sitten seos ja 70 µl pisaroiden muodostusöljyä koettimia varten (Bio-Rad) ladataan vastaavasti kertakäyttöisen pisarageneraattoripatruunan (Bio-Rad) näytekaivoihin ja öljykaivoihin. Sen jälkeen pisarat luodaan QX200-pisarageneraattorilaitteella (Bio-Rad) ja siirretään varovasti 96-kuoppaiselle PCR-levylle (Eppendorf). Jaksoolosuhteet ovat: 95 °C 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 °C 15 s ja 57 °C 1 min ja viimeinen vaihe 98 °C:ssa 10 minuuttia. PCR-reaktion lopussa pisarat luetaan QX200-pisaralukijassa ja analysoidaan käyttämällä Quantasoft™ version 1.7.4 ohjelmistoa (Bio-Rad).

Edut: GH-vasteen kanssa korreloivan miRNA-paneelin perustamisella on valtava kliininen käyttökelpoisuus, mikä mahdollistaa potilaiden nopean tunnistamisen, jotka tarvitsevat erilaisia ​​terapeuttisia protokollia, joiden tavoitteena on saavuttaa paras vaste GH-hoidon aikana.