миРНК как маркер зоны роста после GH

Введение. Клинический опыт терапевтического применения рекомбинантного человеческого гормона роста (GH) показал адекватную реакцию роста у большинства пациентов, получавших лечение по каждому из утвержденных показаний. Однако по мере накопления опыта применения различных схем лечения было признано, что индивидуальные реакции на рост в первый год жизни значительно различаются даже при индивидуально подобранных схемах лечения (1). Плохая краткосрочная реакция также приводит к неудовлетворительному увеличению роста во взрослом возрасте (2).

Некоторые математические модели были разработаны для прогнозирования реакции роста отдельных пациентов. Модели прогнозирования, полученные из большой базы данных Pfizer International Growth Database (KIGS), объясняют примерно 60% вариабельности ответа на терапию ГР у пациентов с ДГР (3). Такие модели учитывают определимую изменчивость чувствительности, позволяя клиницистам подбирать дозу ГР индивидуально для каждого пациента. Основываясь на множественном регрессионном анализе, эти модели идентифицировали факторы, которые коррелируют с ростом (в основном скорость роста в первый год), такие как хронологический возраст, пик GH во время провокационных тестов, доза GH, SDS массы тела при рождении, SDS роста, скорректированные на SDS целевого роста ( 3). Биохимические переменные, такие как исходный уровень IGF-I и лептина, также были добавлены в модели прогнозирования.

Генетические маркеры также использовались в попытке различить хороших и плохих респондентов на лечение ГР, такие как полиморфизм рецептора гормона роста с делецией экзона 3, полиморфизм IGFBP3 и другие, но их результаты были противоречивыми в разных исследованиях.

МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие некодирующие РНК, регулирующие экспрессию генов. Большинство генов в геноме человека регулируются одной или несколькими микроРНК (4). Благодаря своей способности регулировать экспрессию генов miRNAs, по-видимому, играют важную роль в патофизиологии и развитии физиологических процессов, а также в заболеваниях человека (5). МикроРНК обычно подавляют экспрессию генов, связываясь с доменом 3'UTR мРНК (6), тем самым усиливая деградацию мРНК или предотвращая трансляционную информацию и синтез белка.

Одной из замечательных характеристик miRNAs является плазменная циркуляция внутри экзосом, определяющая ее устойчивость к деградации, позволяющая измерять ее в циркулирующей крови, выполняя функцию жидкой биопсии (7).

Научные данные, полученные в различных моделях in vitro и на животных, показали, что miRNAs играют важную роль в регуляции эндохондральной оссификации и в регуляции гипоталамо-гипофизарно-IGF оси (8). В частности, miRNA-140, 322 и 22 были описаны как ответственные за развитие пластинки роста (9). Кателлани и др. показали, что миР-22-3p, миР-30c-5p, миР-106a-5p, миР-140-5p, миР-199a-5p, миР-335-5p, миР-340-5p и миР -494-3p участвует в регуляции продольного роста и развития костей посредством его действия на сигнальные пути WNT-βcatenin, Notch, PI3K/AKT и TGFβ (10).

Реакция роста у пациентов во время лечения ГР варьирует в зависимости как от исходного состояния пациента, так и от индивидуальной врожденной чувствительности к терапии (11). Часто измеренная скорость роста не совпадает с ожидаемой, а степень корреляции между клинико-аукологическими параметрами и дозой и пиком ГР сильно различается как между индивидуумами, так и внутри индивидуумов во время лечения (12).

Таким образом, целью этого исследования является измерение микроРНК, синтезируемых циркулирующей пластинкой роста, до и во время лечения ГР, поиск ее корреляции с клиническими и биохимическими маркерами.

Методы Будут обследованы дети и подростки (n:30 пациентов) обоих полов с дефицитом гормона роста (ДГР), наблюдаемые в отделении детской эндокринологии Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Бразилия. Письменное информированное согласие будет получено от всех участников и их родителей, если это необходимо.

Критерии включения: тест на стимуляцию ГР, показывающий пиковую концентрацию ГР <5 нг/мл, в сочетании с магнитно-резонансной томографией, показывающей эктопию задней доли гипофиза (ЭЗП). Пациенты с комбинированным дефицитом гормонов должны быть компенсированы в течение периода исследования.

Критерии исключения: хронические заболевания, потребность в пролонгированных супрафизиологических дозах глюкокортикоидов, костный возраст >14 лет или >16 лет (девочки и мальчики соответственно), отсутствие адекватного динамического наблюдения за пациентами в рамках протокола исследования.

Клиническое наблюдение: Клинические записи при каждом посещении будут включать возраст, вес, рост, рост до целевой разницы в росте и пубертатную стадию. Клиническая оценка будет проводиться в пяти временных точках: перед началом терапии (базальная) и через 1, 3 и 6 месяцев во время лечения ГР. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывается как вес/рост² (кг/м²). Рост, целевой рост (TH) и ИМТ будут выражены в виде показателя SD (WHO, 2007). Скорость роста SDS будет рассчитана с использованием ссылки Таннера (13). Половое созревание у всех субъектов будет классифицироваться в соответствии с критериями Маршалла и Таннера (14, 15). Костный возраст определяли каждые 6 месяцев и классифицировали по Greulich и Pyle (16).

Лабораторная оценка: Измерения гормонов будут измеряться через 3 и 6 месяцев и будут включать ИФР-1, глюкозу натощак, инсулин, ТТГ и свободный Т4; и кортизол. Гонадотропины и половые стероиды будут измерены, когда они адекватны. Для оценки экспрессии микроРНК, синтезируемых пластинками роста, перед началом терапии ГР или после короткого периода вымывания (15-30 дней) и через 1, 3 и 6 месяцев во время лечения ГР будет получен базальный образец крови.

Определение микроРНК: количественная ПЦР (кПЦР) будет использоваться для измерения уровней циркулирующей микроРНК с использованием капельной цифровой ПЦР (ddPCR), которая считается золотым стандартом в применении жидкой биопсии, поскольку ее превосходная точность и чувствительность менее подвержены влиянию ингибиторами ПЦР и не требуют внутренней/внешней нормализации при обнаружении низкой концентрации молекул нуклеиновых кислот-мишеней. Образец цельной крови будет взят в пробирки для отделения сыворотки vacutainer и обработан в течение 2 часов после сбора, центрифугирован при 2000 g в течение 10 минут при 4°C. Аликвоты сыворотки будут разделены на 1,5 мл стерильных пробирок без РНКаз и дополнительно центрифугированы при 2500 g в течение 10 минут при 4°C для удаления любых загрязняющих клеток и дебриса. Сыворотку собирают в стерильные пробирки без РНКаз и хранят при температуре -80°C до использования. Общая РНК будет выделена из образца с использованием 200 мкл сыворотки с использованием расширенного набора miRNeasy Serum/Plasma (ID: 217204 - Qiagen).

Будут измеряться следующие миРНК: миР-22-3p, миР-30c-5p, миР-106a-5p, миР-140-5p, миР-199a-5p, миР-335-5p, миР-340-5p и миР-494-3п. Для каждого анализа ddPCR в 20 мкл реакционной смеси добавляют 3 мкл образца кДНК, 10 мкл 2× супермикс ddPCR для зондов (Bio-Rad), 1 мкл 20× зонда микроРНК TaqMan и 6 мкл воды без РНКазы. Затем смесь и 70 мкл масла для генерации капель для зондов (Bio-Rad) будут соответственно загружены в лунки для образцов и лунки для масла одноразового картриджа генератора капель (Bio-Rad). После этого капли будут генерироваться генератором капель QX200 (Bio-Rad) и осторожно переноситься на 96-луночный планшет для ПЦР (Eppendorf). Условия циклирования будут следующими: 95°С в течение 10 мин, 40 циклов 95°С в течение 15 с и 57°С в течение 1 мин и последний этап при 98°С в течение 10 мин. В конце реакции ПЦР капли будут считываться в устройстве для считывания капель QX200 и анализироваться с использованием программного обеспечения Quantasoft™ версии 1.7.4 (Bio-Rad).

Преимущества: создание панели miRNAs, которая коррелирует с реакцией на GH, имеет огромную клиническую применимость, позволяя быстро выявлять пациентов, которым нужны дифференцированные терапевтические протоколы, направленные на достижение наилучшего ответа во время лечения GH.