miRNA som en vekstplatemarkør etter GH

Innledning Den kliniske erfaringen med terapeutisk bruk av rekombinant humant veksthormon (GH) har funnet adekvat vekstrespons hos flertallet av pasientene behandlet for hver av de godkjente indikasjonene. Men ettersom erfaringen akkumuleres med ulike behandlingsregimer, ble det erkjent at individuelle førsteårs høyderesponser varierer betydelig selv med individualiserte behandlingsregimer (1). Dårlig korttidsrespons oversettes også til en utilfredsstillende økning i voksenhøyde (2).

Noen matematiske modeller ble utviklet for å forutsi vekstresponsen til en individuell pasient. Prediksjonsmodeller hentet fra den store Pfizer International Growth Database (KIGS)-databasen forklarer omtrent 60 % av variasjonen i respons på GH-behandling hos pasienter med GHD (3). Slike modeller tar hensyn til den definerbare variasjonen av respons, slik at klinikere kan justere GH-dosen til individuelle pasienter. Basert på multiple regresjonsanalyser har disse modellene identifisert faktorer som korrelerer med vekst (hovedsakelig første års veksthastighet), slik som kronologisk alder, GH-topp under provoserende tester, GH-dose, fødselsvekt SDS, høyde SDS justert for målhøyde SDS ( 3). Biokjemiske variabler som baseline IGF-I og leptin er også lagt til prediksjonsmodellene.

Genetiske markører ble også brukt i et forsøk på å skille mellom gode og dårlige respondere på GH-behandling, som exon 3-deleted veksthormonreseptorpolymorfisme, IGFBP3 polymorfisme og andre, men resultatene deres var motstridende i de forskjellige studiene.

MikroRNA (miRNA) er små ikke-kodende RNA som regulerer genuttrykk. De fleste gener i det menneskelige genomet er regulert av en eller flere miRNA (4). På grunn av deres evne til å regulere genuttrykk, ser miRNA ut til å spille en viktig rolle i patofysiologien og utviklingen av fysiologiske prosesser, så vel som i menneskelige sykdommer (5). MikroRNA undertrykker vanligvis genuttrykk ved å binde seg til 3'UTR-domenet til mRNA (6), og øker derfor mRNA-nedbrytning eller forhindrer translasjonsinformasjon og proteinsyntese.

En av de bemerkelsesverdige egenskapene til miRNA er plasmasirkulasjonen inne i eksosomer, som bestemmer dens motstand mot nedbrytning, tillater måling i det sirkulerende blodet, og fungerer som en flytende biopsi (7).

Vitenskapelig bevis i forskjellige in vitro-modeller og hos dyr antydet at miRNA har en viktig rolle i reguleringen av endokondral ossifikasjon og i reguleringen av hypothalamus-hypofyse-IGF-aksen (8). Spesielt miRNA-140, 322 og 22 er blitt beskrevet som ansvarlige for utvikling av vekstplater (9). Catellani et al, viste at miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p og miR -494-3p er involvert i reguleringen av langsgående vekst og beinutvikling, gjennom sin virkning på WNT-βcatenin, Notch, PI3K/AKT og TGFβ signalveier (10).

Vekstrespons hos pasienter under GH-behandling er variabel, avhengig både av pasientens basale tilstander og individuell medfødt sensitivitet for terapi (11). Ofte er den målte vekstraten ikke sammenfallende med den forventede og graden av korrelasjon mellom klinisk-auxologiske parametere og dose og GH-topp varierer enormt, både inter- og intraindividuelt under behandling (12).

Derfor er målet med denne studien å måle de sirkulerende vekstplatesyntetiserte miRNAene før og under GH-behandling, og søke etter dens korrelasjon med kliniske og biokjemiske markører.

Metoder Barn og ungdom (n:30 pasienter), begge kjønn, med GH-mangel (GHD) fulgt ved Pediatric Endocrinology Unit ved Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brasil, vil bli screenet. Skriftlig informert samtykke vil bli innhentet fra alle deltakere og deres foreldre etter behov.

Inklusjonskriterier: GH-stimuleringstest som viser GH-toppkonsentrasjon <5ng/ml, kombinert med magnetisk resonansavbildning som viser posterior hypofyse ektopisk kjertel (EPP). Pasienter med kombinerte hormonmangler skal kompenseres i løpet av studieperioden.

Eksklusjonskriterier: kroniske sykdommer, behov for langvarige suprafysiologiske doser av glukokortikoider, benalder >14 år eller >16 år (henholdsvis jenter og gutter), pasienter som mangler tilstrekkelig oppfølging under studieprotokollen.

Klinisk oppfølging: Kliniske registreringer ved hvert besøk vil inkludere alder, vekt, høyde, høyde til målhøydeforskjell og pubertetsstadium. Klinisk evaluering vil bli tatt på fem tidspunkter: før behandlingsstart (basal), og etter 1, 3 og 6 måneder under GH-behandling. Kroppsmasseindeksen (BMI) vil bli beregnet som vekt/høyde² (kg/m²). Høyde, målhøyde (TH) og BMI vil bli uttrykt som en SD-score (WHO, 2007). Veksthastighet SDS vil bli beregnet ved å bruke Tanner-referanse (13). Puberteten i alle fag vil bli klassifisert etter Marshall og Tanners kriterier (14, 15). Benalderen vil bli innhentet hver 6. måned og klassifisert i henhold til Greulich og Pyle (16).

Laboratorievurdering: Hormonmålinger vil bli målt ved 3 og 6 måneder og vil inkludere IGF-I, fastende glukose, insulin, TSH og fri T4; og kortisol. Gonadotropiner og kjønnssteroider vil bli målt når det er tilstrekkelig. For å evaluere uttrykket av vekstplatesyntetiserte miRNA, vil en basal blodprøve bli tatt før oppstart av GH-behandling eller etter en kort tids utvaskingsperiode (15-30 dager) og etter 1-, 3- og 6-måneder under GH-behandling.

MiRNA-bestemmelse: kvantitativ PCR (qPCR) vil bli brukt til å måle sirkulerende miRNA-nivåer, ved å bruke dråpen digital PCR (ddPCR), ansett for å være gullstandarden ved bruk av flytende biopsi, fordi dens overlegne presisjon og følsomhet er mindre påvirket av PCR-hemmere, og krever ikke intern/ekstern normalisering mens de påviser lav konsentrasjon av målnukleinsyremolekyler. En helblodsprøve vil bli tatt i vacutainer-serumseparatorrør, og behandlet innen 2 timer fra innsamling, sentrifugert ved 2000 g i 10 minutter ved 4°C. Serum vil bli delt opp i 1,5 ml sterile RNase-frie rør og sentrifugert videre ved 2500 g i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne eventuelle forurensningsceller og rusk. Serum samles i sterile RNase-frie rør og lagres ved -80°C frem til bruk. Totalt RNA vil bli isolert fra prøven ved å bruke 200 ul serum ved bruk av miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (ID: 217204 - Qiagen).

Følgende miRNA-er vil bli målt: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p, og miR-494-3p. For hver ddPCR-analyse vil 3 μL cDNA-prøve, 10 μL 2x ddPCR supermix for prober (Bio-Rad), 1 μL 20x TaqMan miRNA-probe og 6 μL RNase-fritt vann tilsettes i en 20 μL reaksjonsblanding. Deretter vil blandingen og 70 μL dråpegenereringsolje for prober (Bio-Rad) lastes inn i henholdsvis prøvebrønnene og oljebrønnene til en engangsdråpegeneratorkassett (Bio-Rad). Etter det vil dråper genereres av QX200 dråpegeneratorenhet (Bio-Rad) og forsiktig overført til en 96-brønners PCR-plate (Eppendorf). Sykkelforholdene vil være: 95 °C i 10 minutter, 40 sykluser på 95 °C i 15 s og 57 °C i 1 min, og et siste trinn ved 98 °C i 10 minutter. På slutten av PCR-reaksjonen vil dråpene bli lest i QX200 dråpeleseren og analysert ved hjelp av Quantasoft™ versjon 1.7.4-programvaren (Bio-Rad).

Fordeler: Etablering av et panel av miRNA-er som korrelerer med GH-respons er av enorm klinisk anvendelighet, noe som muliggjør umiddelbar identifikasjon av pasienter som trenger differensielle terapeutiske protokoller målrettet for å oppnå den beste responsen under GH-behandling.