miRNA como um marcador de placa de crescimento após GH

Introdução A experiência clínica com o uso terapêutico do hormônio de crescimento humano (GH) recombinante tem encontrado resposta de crescimento adequada na maioria dos pacientes tratados para cada uma das indicações aprovadas. No entanto, à medida que a experiência se acumula com diferentes regimes de tratamento, foi reconhecido que as respostas individuais de altura no primeiro ano variam consideravelmente, mesmo com regimes de tratamento individualizados (1). A má resposta a curto prazo também se traduz em um ganho insatisfatório na altura adulta (2).

Alguns modelos matemáticos foram desenvolvidos para prever a resposta de crescimento de pacientes individuais. Os modelos de previsão derivados do grande banco de dados Pfizer International Growth Database (KIGS) explicam aproximadamente 60% da variabilidade da resposta à terapia com GH em pacientes com GHD (3). Esses modelos respondem pela variabilidade definível da capacidade de resposta, permitindo que os médicos ajustem a dose de GH para cada paciente. Com base em análises de regressão múltipla, esses modelos identificaram fatores que se correlacionam com o crescimento (principalmente a velocidade de crescimento no primeiro ano), como idade cronológica, pico de GH durante testes provocativos, dose de GH, SDS de peso ao nascer, SDS de altura ajustado para SDS de altura alvo ( 3). Variáveis ​​bioquímicas como IGF-I e leptina basais também foram adicionadas aos modelos de predição.

Marcadores genéticos também foram utilizados na tentativa de discriminar bons e maus respondedores ao tratamento com GH, como o polimorfismo do receptor do hormônio do crescimento deletado no exon 3, polimorfismo IGFBP3 e outros, mas seus resultados foram contraditórios nos diferentes estudos.

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão gênica. A maioria dos genes no genoma humano é regulada por um ou mais miRNAs (4). Devido à sua capacidade de regular a expressão gênica, os miRNAs parecem desempenhar um papel importante na fisiopatologia e desenvolvimento de processos fisiológicos, bem como em doenças humanas (5). Os microRNAs geralmente suprimem a expressão gênica ligando-se ao domínio 3'UTR do mRNA (6), aumentando assim a degradação do mRNA ou impedindo a informação translacional e a síntese proteica.

Uma das características marcantes dos miRNAs é a circulação do plasma no interior dos exossomos, determinando sua resistência à degradação, permitindo sua mensuração no sangue circulante, funcionando como uma biópsia líquida (7).

Evidências científicas em diferentes modelos in vitro e em animais sugerem que os miRNAs têm um papel importante na regulação da ossificação endocondral e na regulação do eixo hipotálamo-hipófise-IGF (8). Em particular, miRNA-140, 322 e 22 foram descritos como responsáveis ​​pelo desenvolvimento da placa de crescimento (9). Catellani et al, mostraram que miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p e miR -494-3p estão envolvidos na regulação do crescimento longitudinal e desenvolvimento ósseo, através de sua ação nas vias de sinalização WNT-βcatenina, Notch, PI3K/AKT e TGFβ (10).

A resposta de crescimento em pacientes durante o tratamento com GH é variável, dependendo tanto das condições basais do paciente quanto da sensibilidade inata individual à terapia (11). Muitas vezes, a taxa de crescimento medida não coincide com a esperada e o grau de correlação entre os parâmetros clínico-auxológicos e a dose e o pico de GH variam enormemente, tanto inter quanto intraindividualmente durante o tratamento (12).

Portanto, o objetivo deste estudo é medir os miRNAs sintetizados na placa de crescimento circulante antes e durante o tratamento com GH, buscando sua correlação com marcadores clínicos e bioquímicos.

Métodos Serão triadas crianças e adolescentes (n:30 pacientes), de ambos os sexos, com deficiência de GH (DGH) acompanhados na Unidade de Endocrinologia Pediátrica da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brasil. O consentimento informado por escrito será obtido de todos os participantes e de seus pais, conforme apropriado.

Critérios de inclusão: teste de estimulação de GH mostrando concentração de pico de GH <5ng/ml, combinado com ressonância magnética mostrando glândula pituitária posterior ectópica (EPP). Pacientes com deficiências hormonais combinadas devem ser compensados ​​durante o período do estudo.

Critérios de exclusão: doenças crônicas, necessidade de doses suprafisiológicas prolongadas de glicocorticóides, idade óssea >14 anos ou >16 anos (meninas e meninos, respectivamente), falta de acompanhamento adequado durante o protocolo do estudo.

Acompanhamento clínico: Os registros clínicos em cada visita incluirão idade, peso, altura, altura para diferença de altura alvo e estágio puberal. A avaliação clínica será realizada em cinco momentos: antes de iniciar a terapia (basal) e após 1, 3 e 6 meses durante o tratamento com GH. O índice de massa corporal (IMC) será calculado como peso/altura² (kg/m²). Altura, altura alvo (HT) e IMC serão expressos como uma pontuação SD (OMS, 2007). O SDS da velocidade de crescimento será calculado usando a referência de Tanner (13). A puberdade em todos os indivíduos será classificada de acordo com os critérios de Marshall e Tanner (14, 15). A idade óssea será obtida a cada 6 meses e classificada de acordo com Greulich e Pyle (16).

Avaliação Laboratorial: As dosagens hormonais serão feitas aos 3 e 6 meses e incluirão IGF-I, glicemia de jejum, insulina, TSH e T4 livre; e cortisol. Gonadotrofinas e esteróides sexuais serão medidos quando adequados. Para avaliar a expressão de miRNAs sintetizados na placa de crescimento, uma amostra de sangue basal será obtida antes de iniciar a terapia com GH ou após um curto período de washout (15-30 dias) e após 1, 3 e 6 meses durante o tratamento com GH.

Determinação de miRNAs: PCR quantitativo (qPCR) será usado para medir os níveis de miRNA circulantes, empregando o PCR digital de gotículas (ddPCR), considerado padrão ouro na aplicação de biópsia líquida, por sua precisão e sensibilidade superiores, sendo menos afetado por inibidores de PCR e não requerem normalização interna/externa ao detectar baixa concentração de moléculas de ácidos nucleicos alvo. Uma amostra de sangue total será coletada em tubos separadores de soro vacutainer e processada em até 2 horas após a coleta, centrifugada a 2.000 g por 10 minutos a 4°C. O soro será dividido em alíquotas em tubos livres de RNase de 1,5 ml e depois centrifugado a 2.500 g por 10 minutos a 4 ° C para remover quaisquer células contaminantes e detritos. O soro será coletado em tubos estéreis livres de RNase e armazenados a -80°C até o uso. O RNA total será isolado da amostra usando 200 ul de soro usando o kit miRNeasy Serum/Plasma Advanced (ID: 217204 - Qiagen).

Serão medidos os seguintes miRNAs: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p e miR-494-3p. Para cada ensaio de ddPCR, 3 μL de amostra de cDNA, 10 μL de supermix 2× ddPCR para sondas (Bio-Rad), 1 μL de sonda de miRNA 20× TaqMan e 6 μL de água livre de RNase serão adicionados em uma mistura de reação de 20 μL. Em seguida, a mistura e 70 μL de óleo para geração de gotículas para sondas (Bio-Rad) serão carregados respectivamente nos poços de amostra e poços de óleo de um cartucho gerador de gotículas descartável (Bio-Rad). Em seguida, as gotas serão geradas pelo dispositivo gerador de gotículas QX200 (Bio-Rad) e cuidadosamente transferidas para uma placa de PCR de 96 poços (Eppendorf). As condições de ciclagem serão: 95°C por 10 min, 40 ciclos de 95°C por 15 s e 57°C por 1 min, e uma etapa final a 98°C por 10 min. Ao final da reação de PCR, as gotas serão lidas no leitor de gotas QX200 e analisadas com o software Quantassoft™ versão 1.7.4 (Bio-Rad).

Benefícios: Estabelecer um painel de miRNAs correlacionados com a responsividade ao GH é de grande aplicabilidade clínica, permitindo a pronta identificação de pacientes que necessitam de protocolos terapêuticos diferenciados direcionados para alcançar a melhor resposta durante o tratamento com GH.