miRNA jako marker wzrostu płytki po GH

Wstęp Doświadczenie kliniczne z terapeutycznym zastosowaniem rekombinowanego ludzkiego hormonu wzrostu (GH) wykazało odpowiednią odpowiedź wzrostową u większości pacjentów leczonych z każdego z zatwierdzonych wskazań. Jednak w miarę gromadzenia doświadczeń z różnymi schematami leczenia uznano, że indywidualne odpowiedzi wzrostu w pierwszym roku różnią się znacznie, nawet w przypadku zindywidualizowanych schematów leczenia (1). Słaba odpowiedź krótkoterminowa przekłada się również na niezadowalający wzrost dorosłego wzrostu (2).

Opracowano kilka modeli matematycznych w celu przewidywania odpowiedzi wzrostowej poszczególnych pacjentów. Modele prognostyczne pochodzące z dużej bazy danych Pfizer International Growth Database (KIGS) wyjaśniają około 60% zmienności odpowiedzi na terapię hormonem wzrostu u pacjentów z GHD (3). Takie modele uwzględniają definiowalną zmienność odpowiedzi, pozwalając klinicystom dostosować dawkę GH do indywidualnego pacjenta. W oparciu o analizy regresji wielokrotnej modele te zidentyfikowały czynniki korelujące ze wzrostem (głównie tempo wzrostu w pierwszym roku), takie jak wiek chronologiczny, szczyt GH podczas testów prowokacyjnych, dawka GH, SDS masy urodzeniowej, SDS wzrostu skorygowany o SDS wzrostu docelowego ( 3). Do modeli prognostycznych dodano również zmienne biochemiczne, takie jak wyjściowy IGF-I i leptyna.

Markery genetyczne zostały również wykorzystane w próbie rozróżnienia osób dobrze i źle reagujących na leczenie hormonem wzrostu, takich jak polimorfizm receptora hormonu wzrostu z usuniętym eksonem 3, polimorfizm IGFBP3 i inne, ale ich wyniki były sprzeczne w różnych badaniach.

MikroRNA (miRNA) to małe niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów. Większość genów w ludzkim genomie jest regulowana przez jeden lub więcej miRNA (4). Ze względu na zdolność do regulacji ekspresji genów, miRNA wydają się odgrywać ważną rolę w patofizjologii i rozwoju procesów fizjologicznych, a także w chorobach człowieka (5). MikroRNA zwykle hamują ekspresję genów przez wiązanie się z domeną 3'UTR mRNA (6), zwiększając w ten sposób degradację mRNA lub zapobiegając translacji informacji i syntezie białek.

Jedną z niezwykłych cech miRNA jest krążenie osocza wewnątrz egzosomów, określające jego odporność na degradację, umożliwiające jego pomiar w krążącej krwi, wykonujący biopsję płynną (7).

Dowody naukowe w różnych modelach in vitro i na zwierzętach sugerują, że miRNA odgrywają ważną rolę w regulacji kostnienia śródchrzęstnego oraz w regulacji osi podwzgórze-przysadka-IGF (8). W szczególności miRNA-140, 322 i 22 zostały opisane jako odpowiedzialne za rozwój płytek wzrostowych (9). Catellani i wsp. wykazali, że miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p i miR -494-3p biorą udział w regulacji wzrostu podłużnego i rozwoju kości poprzez działanie na szlaki sygnałowe WNT-β-katenina, Notch, PI3K/AKT i TGFβ (10).

Odpowiedź wzrostowa u pacjentów leczonych hormonem wzrostu jest zmienna i zależy zarówno od stanu podstawowego pacjenta, jak i od indywidualnej wrodzonej wrażliwości na terapię (11). Często zmierzone tempo wzrostu nie pokrywa się z oczekiwanym, a stopień korelacji między parametrami kliniczno-auksologicznymi a dawką i szczytem GH jest bardzo różny, zarówno międzyosobniczy, jak i wewnątrzosobniczy w trakcie leczenia (12).

Dlatego celem tego badania jest pomiar miRNA syntetyzowanych przez krążącą płytkę wzrostu przed i podczas leczenia GH, poszukiwanie jego korelacji z klinicznymi i biochemicznymi markerami.

Metody Dzieci i młodzież (n: 30 pacjentów), obojga płci, z niedoborem GH (GHD) obserwowane na Oddziale Endokrynologii Dziecięcej Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brazylia, zostaną przebadane. Pisemna świadoma zgoda zostanie uzyskana od wszystkich uczestników i ich rodziców, w stosownych przypadkach.

Kryteria włączenia: Test stymulacji GH wykazujący szczytowe stężenie GH <5 ng/ml, w połączeniu z rezonansem magnetycznym wykazującym ektopowy gruczoł przysadki (EPP). Pacjenci ze złożonymi niedoborami hormonów muszą otrzymywać wyrównanie w okresie badania.

Kryteria wykluczenia: choroby przewlekłe, konieczność stosowania przedłużonych suprafizjologicznych dawek glikokortykosteroidów, wiek kostny >14 lat lub >16 lat (odpowiednio dziewczęta i chłopcy), pacjenci, którzy nie mieli odpowiedniej obserwacji w trakcie protokołu badania.

Obserwacja kliniczna: Dokumentacja kliniczna podczas każdej wizyty będzie obejmowała wiek, wagę, wzrost, wzrost do docelowej różnicy wzrostu i etap dojrzewania. Ocena kliniczna zostanie przeprowadzona w pięciu punktach czasowych: przed rozpoczęciem terapii (podstawa) oraz po 1, 3 i 6 miesiącach w trakcie leczenia GH. Wskaźnik masy ciała (BMI) zostanie obliczony jako waga/wzrost² (kg/m²). Wzrost, wzrost docelowy (TH) i BMI zostaną wyrażone jako wynik SD (WHO, 2007). Szybkość wzrostu SDS zostanie obliczona przy użyciu odniesienia Tannera (13). Dojrzewanie we wszystkich przedmiotach zostanie sklasyfikowane zgodnie z kryteriami Marshalla i Tannera (14, 15). Wiek kostny będzie oznaczany co 6 miesięcy i klasyfikowany według Greulicha i Pyle'a (16).

Ocena laboratoryjna: Pomiary hormonów będą mierzone po 3 i 6 miesiącach i będą obejmować IGF-I, glukozę na czczo, insulinę, TSH i wolną T4; i kortyzolu. Gonadotropiny i steroidy płciowe będą mierzone, gdy będą odpowiednie. Aby ocenić ekspresję miRNA syntetyzowanych w płytkach wzrostowych, przed rozpoczęciem terapii hormonem wzrostu lub po krótkim okresie wypłukiwania (15-30 dni) oraz po 1, 3 i 6 miesiącach w trakcie leczenia GH pobiera się podstawową próbkę krwi.

Oznaczanie miRNA: ilościowa metoda PCR (qPCR) zostanie wykorzystana do pomiaru poziomów miRNA w krążeniu, poprzez zastosowanie cyfrowej PCR kropelkowej (ddPCR), uważanej za złoty standard w stosowaniu płynnej biopsji, ponieważ jej doskonała precyzja i czułość, będąca mniej przez inhibitory PCR i nie wymagają wewnętrznej/zewnętrznej normalizacji przy wykrywaniu niskich stężeń docelowych cząsteczek kwasów nukleinowych. Próbka krwi pełnej zostanie pobrana do probówek Vacutainer z separatorem surowicy i przetworzona w ciągu 2 godzin od pobrania, odwirowana przy 2000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Surowica zostanie podzielona na porcje w sterylnych probówkach wolnych od RNaz o pojemności 1,5 ml i dalej wirowana przy 2500 g przez 10 min w temperaturze 4°C w celu usunięcia wszelkich komórek zanieczyszczających i pozostałości. Surowica zostanie pobrana do sterylnych probówek wolnych od RNaz i będzie przechowywana w temperaturze -80°C do momentu użycia. Całkowity RNA zostanie wyizolowany z próbki przy użyciu 200 ul surowicy przy użyciu zaawansowanego zestawu miRNeasy Serum/Plasma (ID: 217204 - Qiagen).

Zmierzone zostaną następujące miRNA: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p i miR-494-3p. Do każdego testu ddPCR, 3 μl próbki cDNA, 10 μl 2× ddPCR supermix dla sond (Bio-Rad), 1 μl 20× sondy TaqMan miRNA i 6 μl wody wolnej od RNazy zostaną dodane do 20 μl mieszaniny reakcyjnej. Następnie mieszanina i 70 μl oleju wytwarzającego krople do sond (Bio-Rad) zostaną odpowiednio załadowane do studzienek na próbki i studzienek naftowych jednorazowego wkładu generatora kropel (Bio-Rad). Następnie kropelki będą generowane przez generator kropel QX200 (Bio-Rad) i ostrożnie przenoszone na 96-dołkową płytkę do PCR (Eppendorf). Warunki cyklu będą następujące: 95°C przez 10 min, 40 cykli w 95°C przez 15 s i 57°C przez 1 min oraz ostatni etap w 98°C przez 10 min. Pod koniec reakcji PCR kropelki zostaną odczytane w czytniku kropli QX200 i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania Quantasoft™ w wersji 1.7.4 (Bio-Rad).

Korzyści: Ustanowienie panelu miRNA korelującego z reakcją na GH ma ogromne zastosowanie kliniczne, umożliwiając szybką identyfikację pacjentów, którzy potrzebują zróżnicowanych protokołów terapeutycznych ukierunkowanych na osiągnięcie najlepszej odpowiedzi podczas leczenia GH.