非外科的歯周治療に応答する唾液プロテオーム

研究対象集団と臨床検査

トルコのアイドゥンにあるアイドゥン・アドナン・メンデレス大学歯学部歯周病学科で、ステージIII、グレードCの歯周炎を患っている全身的に健康で非喫煙者計10人が募集された。

口全体の歯周評価には、ベースライン（T0）、治療後 1 か月（T1）および 6 か月（T6）におけるプロービングの深さ、臨床的アタッチメントロス、プロービング時の出血部位の割合、歯肉指数、プラーク指数の測定が含まれます。 。 すべての測定値は、手動歯周プローブ (William の歯周プローブ、Hu-Friedy、イリノイ州シカゴ) を使用して、第三大臼歯を除く歯あたり 6 部位から得られました。 各参加者の歯槽骨吸収をデジタルパノラマ X 線写真で評価しました。 すべての臨床測定は、経験豊富な歯周病専門医 (BA) によって実行されました。

ステージ III、グレード C の歯周炎の診断は、2017 年の歯周病およびインプラント周囲の疾患および状態の分類に関する国際ワークショップによって提案された基準に従って行われました。

処理

従来の四分円ごとのスケーリングとルートプレーニング（SRP）は、唾液採取と歯周評価後のベースラインで右上四分円から始めて時計回りに週間隔で4回の訪問で続けられました。 SRPは、同じ歯周病専門医（B.A.）が局所麻酔下で、超音波器具（ミニピエゾン、EMS、スイス連邦ニヨン）および手動歯周キュレット（グレーシーキュレット、スケーラーHu-Friedy、イリノイ州シカゴ）を使用して実施されました。 根の表面が視覚的にも触覚的にもきれいで滑らかになるまで、現在のすべての歯に器具を取り付けました。 自己実施のプラークコントロール対策は、中程度の歯ブラシとフッ化物を含む通常の歯磨き粉を使用した修正バス法を使用した歯磨きを 1 日 2 回行い、デンタルフロスおよび/または歯間ブラシを使用した歯間清掃を 1 日 1 回行うことから構成されていました。 フォローアップの唾液サンプリングと歯周評価は、SRP 完了後の T1 と T6 に実施されました。

唾液採取

朝、T0、T1、および T6 の午前 8:00 ～ 10:00 の間に、参加者から未刺激の全唾液を採取しました。 すべての患者は、サンプリング前の 2 時間、飲食およびすべての口腔衛生処置を控えるよう要求されました。 患者はまず水道水で口をすすぎ、サンプルの希釈を避けるために5分間待つように指示されました。 刺激されていない唾液を 5 分間にわたって収集しました。患者には、受動的よだれを促し、滅菌万能ポリプロピレン容器チューブに喀出するように頭を前に傾けて座るよう指示された。 サンプリング後、サンプルは直ちに冷蔵保管庫 (4 °C) に移され、小分けされ、必要になるまで -80 °C で冷凍されました。

ラベルフリーの定量的プロテオミクス分析

T0、T1、および T6 で収集された唾液上清サンプル (n = 30) を、ラベルフリー定量的 (LFQ) プロテオミクス アプローチを使用して分析しました。

サンプルの準備

サンプルは、最新バージョンのプロトコルを備えた市販の iST キット (PreOmics、ドイツ) を使用して調製されました。 タンパク質濃度は、Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies、スイス、チューリッヒ) を使用して推定されました。 各サンプルについて、50 μg のタンパク質をカートリッジに移し、50 μL の「消化」溶液を加えて消化しました。 37℃で60分間インキュベートした後、100μLの停止溶液で消化を停止しました。 カートリッジ内の溶液は 3800 g での遠心分離によって除去されましたが、ペプチドは iST フィルターによって保持されました。 最後に、ペプチドを洗浄、溶出、乾燥し、20 μL の注入緩衝液 (3% アセトニトリル、0.1% ギ酸) に再可溶化しました。

液体クロマトグラフィー・質量分析分析

質量分析は、Digital PicoView ソース (New Objective) を備え、M-Class UPLC (Waters) に接続された Q Exactive HF-X 質量分析計 (Thermo Scientific) で実行されました。 2 つのチャネルの溶媒組成は、チャネル A では 0.1% ギ酸、チャネル B では 0.1% ギ酸、99.9% アセトニトリルでした。各サンプルについて、2 μL のペプチドを市販の MZ Symmetry C18 トラップ カラム (100 Å、5 μm) にロードしました。 、１８０μｍ×２０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）に続いて、ｎａｎｏＥａｓｅ ＭＺ Ｃ１８ ＨＳＳ Ｔ３カラム（１００Å、１．８μｍ、７５μｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。 ペプチドを、流速３００ｎＬ／分で、８５分で８〜２７％Ｂ、５分で３５％Ｂ、１分で８０％Ｂの勾配により溶出した。 サンプルはランダムな順序で取得されました。 質量分析計はデータ依存モード (DDA) で動作し、目標値まで蓄積した後、200 m/z で 120,000 の分解能でフルスキャン MS スペクトル (350 ～ 1,400 m/z) を取得しました。 3,000,000 に続いて、サイクルあたり 20 個の最も強度の高い信号に対する HCD (高エネルギー衝突解離) フラグメンテーションが続きます。 HCD スペクトルは、正規化された衝突エネルギー 28 および最大注入時間 22 ms を使用して、解像度 15,000 で取得されました。 自動利得制御 (AGC) は 100,000 イオンに設定されました。 充電状態のスクリーニングが有効になりました。 単一、未割り当て、および 7 より高いチャージ状態は拒否されました。 MS/MS には、強度が 250,000 を超える前駆体のみが選択されました。 MS/MS 測定用に以前に選択された前駆体質量は、30 秒間さらなる選択から除外され、除外ウィンドウは 10 ppm に設定されました。 サンプルは、m/z 371.1012 および 445.1200 で内部ロック質量校正を使用して取得されました。

タンパク質の同定と定量化

取得した生の MS データは MaxQuant (バージョン 1.6.2.3) によって処理され、統合された Andromeda 検索エンジンを使用してタンパク質が同定されました。 分析はローカル検査室情報管理システム (LIMS) 上で実行されました。 スペクトルは、Uniprot ヒト参照プロテオーム (分類法 9606、正規バージョン 20180703 から) およびヒト口腔マイクロバイオーム データベース (http://www.homd.org/) を含むデータベースに対して検索されました。 バージョン注釈付きゲノム 460+、20180702)、逆デコイされた fasta データベースと一般的なタンパク質汚染物質に連結されています。 システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定し、メチオニンの酸化とN末端タンパク質のアセチル化を可変として設定しました。 酵素特異性はトリプシン/P に設定され、最小ペプチド長は 7 アミノ酸、最大 2 回の切断ミスが許容されます。 MaxQuant Orbitrap のデフォルトの検索設定が使用されました。 最大誤発見率 (FDR) は、ペプチドの場合は 0.01、タンパク質の場合は 0.05 に設定されました。 LFQ が有効になり、実行間の試合には 2 分間のウィンドウが適用されました。 MaxQuant 実験計画テンプレートでは、個々の定量値を取得するために、実験計画内で各ファイルが別々に保持されます。

タンパク質の強度と調節

R パッケージ prolfqua に実装された一連の R 関数を使用して、発現差解析を実行しました。 MaxQuant によって報告されたペプチド強度は、サンプルの平均と分散が等しくなるように log2 変換され、次に z 変換されました。 次に、Tukey のメディアンポリッシュを使用して、ペプチド強度から正規化されたタンパク質強度を推定しました。 タンパク質のlog2倍変化は、正規化されたタンパク質強度に基づいて計算されました。 2 つの要素 (時間と患者) を含む線形モデルを各タンパク質に当てはめ、モデル パラメーターに基づいてグループの差異を推定し、テストしました。 分散推定値は、ハイスループット実験の並列構造を利用する経験的ベイズアプローチを使用して緩和され、帰無仮説有意性検定の統計的検出力が向上します。 最後に、Benjamini と Hochberg の手順を使用して p 値を調整し、FDR を取得しました。 時点間で示差的に調節されたタンパク質（T1対T0、T6対T0、およびT6対T1）は、FDR <0.05で考慮されました。 主成分分析は、R 関数 'prcomp' を使用して視覚化を目的として実行されました。

経路解析

差次的に制御されたヒトタンパク質 (FDR <0.05) をさらに QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) アプリケーション (QIAGEN Inc.、https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) に供し、どの疾患や生物学的プロセスが制御によって影響を受けるかを調査しました。プロテオーム データセットの変更。 この分析は、調節されたタンパク質と関連する疾患または機能との間の予想される因果関係に基づいています。 IPA は、ジャーナル論文やデータベースからの科学情報と生物医学情報を組み合わせた QIAGEN のナレッジ ベースに基づく強力なバイオインフォマティクス分析ツールであり、広範囲のオミクス発現データの解釈と、潜在的な規制ネットワークと因果関係の予測を可能にします。 2022 年 4 月 12 日に、T1 対 T0 および T6 対 T0 の log2 倍変化と FDR データに基づいてコア分析が実行され、FDR によってランク付けされた上位の規制疾患および生物学的プロセスが特定されました。 さらに、Z スコア予測アルゴリズムが適用され、疾患または機能活動は、Z スコアが 2 以上または 2 未満の場合にそれぞれ有意な増加 (正の Z スコア) または減少 (負の Z スコア) として分類され、次のように表示されます。異なる正方形サイズ (FDR) と色 (Z スコア) のヒートマップ。 大きな四角は、データセット内の制御タンパク質と特定の疾患または機能との間のより重要な重複を示し、四角の色は疾患または機能の変化の方向を反映します (オレンジ: 増加、青: 減少)。 特定の疾患または機能に関連するタンパク質は、タンパク質の機能、タンパク質制御 (上方制御または下方制御)、および予測される関連/相互作用の種類 (間接的または直接、活性化または阻害) を示すネットワーク チャートとして表示されます。

統計分析

R パッケージ prolfqua に実装された一連の R 関数を使用して、発現差解析を実行しました。 MaxQuant によって報告されたペプチド強度は、サンプルの平均と分散が等しくなるように log2 変換され、次に z 変換されました。 次に、Tukey のメディアンポリッシュを使用して、ペプチド強度から正規化されたタンパク質強度を推定しました。 タンパク質のlog2倍変化は、正規化されたタンパク質強度に基づいて計算されました。 2 つの要素 (時間と患者) を含む線形モデルを各タンパク質に当てはめ、モデル パラメーターに基づいてグループの差異を推定し、テストしました。 分散推定値は、ハイスループット実験の並列構造を利用する経験的ベイズアプローチを使用して緩和され、帰無仮説有意性検定の統計的検出力が向上します。 最後に、Benjamini と Hochberg の手順を使用して p 値を調整し、FDR を取得しました。 時点間で示差的に調節されたタンパク質（T1対T0、T6対T0、およびT6対T1）は、FDR <0.05で考慮されました。 主成分分析は、R 関数 'prcomp' を使用して視覚化を目的として実行されました。