Proteoma salival en respuesta al tratamiento periodontal no quirúrgico

Población de estudio y examen clínico

Se reclutó un total de 10 personas sistémicamente sanas y no fumadoras con periodontitis en etapa III, grado C en el Departamento de Periodoncia, Facultad de Odontología, Universidad Aydın Adnan Menderes, Aydın, Turquía.

La evaluación periodontal de toda la boca incluyó mediciones de profundidad de sondaje, pérdida de inserción clínica, porcentaje de sitios con sangrado al sondaje, índice gingival e índice de placa al inicio (T0) y un mes (T1) y seis meses (T6) después del tratamiento. . Todas las medidas se obtuvieron de 6 sitios por diente excluyendo los terceros molares utilizando una sonda periodontal manual (sonda periodontal de William, Hu-Friedy, Chicago, IL). La reabsorción ósea alveolar se evaluó en la radiografía panorámica digital en cada participante. Todas las mediciones clínicas fueron realizadas por un periodoncista experimentado (B.A.).

El diagnóstico de periodontitis estadio III, grado C se realizó de acuerdo con los criterios propuestos por el Taller Internacional sobre la Clasificación de Enfermedades y Condiciones Periodontales y Periimplantarias de 2017.

Tratamiento

El raspado y alisado radicular (SRP) convencional por cuadrantes se realizó al inicio del estudio, después de la recolección de saliva y la evaluación periodontal, comenzando con el cuadrante superior derecho y continuando en el sentido de las agujas del reloj durante cuatro visitas a intervalos semanales. La SRP fue realizada bajo anestesia local por el mismo periodoncista (B.A.) mediante el uso de instrumentos ultrasónicos (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) y curetas periodontales manuales (curetas Gracey, raspador Hu-Friedy, Chicago, IL). Todos los dientes presentes fueron instrumentados hasta que la superficie de la raíz estuvo visual y táctilmente limpia y lisa. Las medidas autoadministradas de control de placa consistieron en el cepillado dental mediante la técnica de Bass modificada con un cepillo de dientes mediano y una pasta dental regular con flúor dos veces al día y limpieza interdental con hilo dental y/o cepillos interdentales una vez al día. El muestreo de saliva de seguimiento y las evaluaciones periodontales se realizaron en T1 y T6 después de completar SRP.

Muestreo de saliva

Se obtuvo saliva total no estimulada de los participantes por la mañana entre las 8:00 am y las 10:00 am en T0, T1 y T6. Se solicitó a todos los pacientes que se abstuvieran de comer, beber y realizar todos los procedimientos de higiene bucal durante las 2 horas previas a la toma de muestras. Primero se pidió a los pacientes que se enjuagaran la boca con agua del grifo y esperaran 5 minutos para evitar la dilución de la muestra. La saliva no estimulada se recogió durante un período de 5 minutos; Se instruyó a los pacientes para que se sentaran con la cabeza inclinada hacia adelante para fomentar el babeo pasivo, expectorando en un tubo contenedor universal estéril de polipropileno. Después del muestreo, las muestras se transfirieron inmediatamente a almacenamiento refrigerado (4 °C), se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C hasta que se necesitaron.

Análisis proteómico cuantitativo sin etiquetas

Las muestras de sobrenadante de saliva recolectadas en T0, T1 y T6 (n = 30) se analizaron utilizando un enfoque proteómico cuantitativo sin etiquetas (LFQ).

preparación de la muestra

Las muestras se prepararon utilizando un iST Kit comercial (PreOmics, Alemania) con una versión actualizada del protocolo. La concentración de proteínas se estimó utilizando el kit de ensayo de proteínas Qubit® (Life Technologies, Zúrich, Suiza). Para cada muestra, se transfirieron 50 µg de proteína al cartucho y se digirieron agregando 50 µL de la solución 'Digest'. Después de 60 minutos de incubación a 37 °C, se detuvo la digestión con 100 µL de solución de parada. Las soluciones del cartucho se eliminaron por centrifugación a 3800 g, mientras que los péptidos se retuvieron en el filtro iST. Finalmente, los péptidos se lavaron, eluyeron, secaron y resolubilizaron en 20 µL de tampón de inyección (acetonitrilo al 3%, ácido fórmico al 0,1%).

Análisis por cromatografía líquida-espectrometría de masas

El análisis de espectrometría de masas se realizó en un espectrómetro de masas Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) equipado con una fuente Digital PicoView (New Objective) y acoplado a un M-Class UPLC (Waters). La composición del solvente en los dos canales fue ácido fórmico al 0,1 % para el canal A y ácido fórmico al 0,1 %, acetonitrilo al 99,9 % para el canal B. Para cada muestra, se cargaron 2 μL de péptidos en una columna trampa comercial MZ Symmetry C18 (100 Å, 5 µm , 180 µm x 20 mm, Waters) seguida de la columna nanoEase MZ C18 HSS T3 (100 Å, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). Los péptidos se eluyeron a un caudal de 300 nl/min con un gradiente de 8 a 27 % B en 85 min, 35 % B en 5 min y 80 % B en 1 min. Las muestras se adquirieron en un orden aleatorio. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo dependiente de datos (DDA), adquiriendo un espectro de MS de barrido completo (350 - 1400 m/z) a una resolución de 120 000 a 200 m/z después de la acumulación a un valor objetivo de 3'000'000, seguido de fragmentación HCD (disociación de colisión de alta energía) en las veinte señales más intensas por ciclo. Los espectros HCD se adquirieron a una resolución de 15.000 utilizando una energía de colisión normalizada de 28 y un tiempo de inyección máximo de 22 ms. El control automático de ganancia (AGC) se fijó en 100.000 iones. Se habilitó la detección del estado de carga. Se rechazaron estados individuales, no asignados y de carga superiores a siete. Solo se seleccionaron precursores con una intensidad superior a 250.000 para MS/MS. Las masas de precursores previamente seleccionadas para la medición MS/MS se excluyeron de la selección adicional durante 30 s, y la ventana de exclusión se fijó en 10 ppm. Las muestras se adquirieron utilizando calibración de masa de bloqueo interno en m/z 371,1012 y 445,1200.

Identificación y cuantificación de proteínas

Los datos de MS sin procesar adquiridos fueron procesados ​​por MaxQuant (versión 1.6.2.3), seguido de la identificación de proteínas utilizando el motor de búsqueda integrado Andromeda. El análisis se ejecutó en el sistema de gestión de información de laboratorio local (LIMS). Los espectros se buscaron en una base de datos que contenía el proteoma de referencia humano Uniprot (taxonomía 9606, versión canónica de 20180703) y la base de datos de microbiomas orales humanos (http://www.homd.org/, versión anotada de genomas 460+, 20180702), concatenados a su base de datos fasta señuelo invertida y contaminantes de proteínas comunes. La carbamidometilación de la cisteína se estableció como modificación fija, mientras que la oxidación de la metionina y la acetilación de la proteína N-terminal se establecieron como variables. La especificidad de la enzima se fijó en tripsina/P, lo que permitió una longitud peptídica mínima de 7 aminoácidos y un máximo de dos escisiones perdidas. Se utilizaron los ajustes de búsqueda predeterminados de MaxQuant Orbitrap. La tasa máxima de descubrimiento falso (FDR) se fijó en 0,01 para péptidos y 0,05 para proteínas. Se habilitó LFQ y se aplicó una ventana de dos minutos para coincidencias entre carreras. En la plantilla de diseño experimental MaxQuant, cada archivo se mantiene separado en el diseño experimental para obtener valores cuantitativos individuales.

Intensidades y regulación de proteínas

Se utilizó un conjunto de funciones R implementadas en el paquete R prolfqua para realizar el análisis de expresión diferencial. Las intensidades de péptido informadas por MaxQuant se transformaron en log2 y luego se transformaron en z para que las medias y las varianzas de la muestra fueran iguales. A continuación, se estimaron las intensidades de proteínas normalizadas a partir de las intensidades de péptidos utilizando el pulido medio de Tukey. Los cambios de proteína log2 veces se calcularon en función de las intensidades de proteína normalizadas. Se ajustó un modelo lineal con dos factores (tiempo y paciente) a cada proteína, y se estimaron y probaron las diferencias de grupo en función de los parámetros del modelo. Las estimaciones de varianza se moderaron utilizando el enfoque empírico de Bayes, que explota la estructura paralela del experimento de alto rendimiento, lo que aumenta el poder estadístico de la prueba de significación de la hipótesis nula. Finalmente, los valores de p se ajustaron utilizando el procedimiento de Benjamini y Hochberg para obtener los FDR. Las proteínas reguladas diferencialmente entre los puntos temporales (T1 frente a T0, T6 frente a T0 y T6 frente a T1) se consideraron en FDR <0,05. El análisis de componentes principales se realizó con fines de visualización utilizando la función R 'prcomp'.

Análisis de ruta

Las proteínas humanas reguladas diferencialmente (FDR <0,05) se sometieron además a la aplicación Ingenuity Pathway Analysis (IPA) de QIAGEN (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) para investigar qué enfermedades y procesos biológicos se vieron afectados por la regulación. cambios en nuestro conjunto de datos de proteoma. El análisis se basa en los efectos causales esperados entre las proteínas reguladas y las enfermedades o funciones asociadas. IPA es una poderosa herramienta de análisis bioinformático, basada en la base de conocimiento de QIAGEN que combina información científica y biomédica de artículos de revistas y bases de datos, que permite la interpretación de una amplia gama de datos de expresión ómica y predicciones de posibles redes regulatorias y relaciones causales. Se realizó un análisis central el 12 de abril de 2022 basado en el cambio log2 veces y los datos de FDR para T1 frente a T0 y T6 frente a T0, y se identificaron los principales procesos biológicos y de enfermedades regulados clasificados por FDR. Además, se aplicó un algoritmo de predicción de puntuación z y la enfermedad o las actividades funcionales se clasificaron como significativamente aumentadas (puntuaciones z positivas) o disminuidas (puntuaciones z negativas) para puntuaciones z de ≥2 o ≤-2, respectivamente y presentadas como mapas de calor con diferentes tamaños de cuadrados (FDR) y colores (z-scores). Los cuadrados más grandes indican una superposición más significativa entre las proteínas reguladas en el conjunto de datos y una enfermedad o función específica, mientras que los colores de los cuadrados reflejan la dirección del cambio de una enfermedad o función (naranja: aumento, azul: disminución). Las proteínas asociadas con una enfermedad o función específica se presentaron como gráficos de red que indican la función de la proteína, la regulación de la proteína (regulada hacia arriba o hacia abajo) y el tipo previsto de asociación/interacción (indirecta o directa, activación o inhibición).

Análisis estadístico

Se utilizó un conjunto de funciones R implementadas en el paquete R prolfqua para realizar el análisis de expresión diferencial. Las intensidades de péptido informadas por MaxQuant se transformaron en log2 y luego se transformaron en z para que las medias y las varianzas de la muestra fueran iguales. A continuación, se estimaron las intensidades de proteínas normalizadas a partir de las intensidades de péptidos utilizando el pulido medio de Tukey. Los cambios de proteína log2 veces se calcularon en función de las intensidades de proteína normalizadas. Se ajustó un modelo lineal con dos factores (tiempo y paciente) a cada proteína, y se estimaron y probaron las diferencias de grupo en función de los parámetros del modelo. Las estimaciones de varianza se moderaron utilizando el enfoque empírico de Bayes, que explota la estructura paralela del experimento de alto rendimiento, lo que aumenta el poder estadístico de la prueba de significación de la hipótesis nula. Finalmente, los valores de p se ajustaron utilizando el procedimiento de Benjamini y Hochberg para obtener los FDR. Las proteínas reguladas diferencialmente entre los puntos temporales (T1 frente a T0, T6 frente a T0 y T6 frente a T1) se consideraron en FDR <0,05. El análisis de componentes principales se realizó con fines de visualización utilizando la función R 'prcomp'.