Spyttproteom som svar på ikke-kirurgisk periodontal behandling

Studiepopulasjon og klinisk undersøkelse

Totalt 10 systemisk friske og ikke-røykere med stadium III, grad C periodontitt ble rekruttert ved Institutt for periodontologi, School of Dentistry, Aydın Adnan Menderes University, Aydın, Tyrkia.

Full-munn periodontal vurdering inkluderte målinger av sonderingsdybde, klinisk tilknytningstap, prosentandelen av steder med blødning ved sondering, gingivalindeks og plakkindeks ved baseline (T0) og én måned (T1) og seks måneder (T6) etter behandling . Alle målinger ble oppnådd fra 6 steder per tann unntatt tredje molarer ved bruk av en manuell periodontal probe (Williams periodontal probe, Hu-Friedy, Chicago, IL). Den alveolære benresorpsjonen ble vurdert på det digitale panorama røntgenbildet hos hver deltaker. Alle kliniske målinger ble utført av en erfaren periodontist (B.A.).

Diagnose av stadium III, grad C periodontitt ble utført i henhold til kriteriene foreslått av 2017 International Workshop on the Classification of Periodontal and Peri-implant Diseases and Conditions.

Behandling

Konvensjonell kvadrantvis skalering og rotplaning (SRP) ble utført ved baseline, etter spyttinnsamling og periodontal vurdering, startet med øvre høyre kvadrant og fortsatte med klokken over fire besøk med ukentlige intervaller. SRP ble utført under lokalbedøvelse av samme periodontist (B.A.) ved bruk av ultralydinstrumenter (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) og manuelle periodontale curetter (Gracey curets, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Alle tilstedeværende tenner ble instrumentert til rotoverflaten var visuelt og taktil ren og glatt. Selvutførte plakkkontrolltiltak besto av tannbørsting ved bruk av den modifiserte Bass-teknikken med en middels tannbørste og en vanlig tannkrem med fluor to ganger daglig og interdental rengjøring med tanntråd og/eller interdentale børster en gang daglig. Oppfølgende spyttprøvetaking og periodontale vurderinger ble utført ved T1 og T6 etter fullført SRP.

Spyttprøvetaking

Ustimulert hel spytt ble hentet fra deltakerne om morgenen mellom 8:00 – 10:00 ved T0, T1 og T6. Alle pasienter ble bedt om å avstå fra å spise, drikke og alle munnhygieneprosedyrer i 2 timer før prøvetaking. Pasientene ble først bedt om å skylle munnen med vann fra springen og vente i 5 minutter for å unngå prøvefortynning. Ustimulert spytt ble samlet over en 5-minutters periode; Pasientene ble bedt om å sitte med hodet vippet forover for å oppmuntre til passiv sikling, og ekspektorere inn i et sterilt universal polypropylenbeholderrør. Etter prøvetaking ble prøvene umiddelbart overført til kjølelager (4 °C), alikvotert og frosset ved -80 °C inntil nødvendig.

Etikettfri kvantitativ proteomisk analyse

Spyttsupernatantprøver samlet ved T0, T1 og T6 (n = 30) ble analysert ved bruk av en merkefri kvantitativ (LFQ) proteomisk tilnærming.

Prøveforberedelse

Prøver ble utarbeidet ved å bruke et kommersielt iST Kit (PreOmics, Tyskland) med en oppdatert versjon av protokollen. Proteinkonsentrasjonen ble estimert ved bruk av Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zürich, Sveits). For hver prøve ble 50 µg protein overført til patronen og fordøyd ved å tilsette 50 µL av 'Digest'-løsningen. Etter 60 minutters inkubering ved 37 °C ble fordøyelsen stoppet med 100 µL Stop-løsning. Løsningene i patronen ble fjernet ved sentrifugering ved 3800 g, mens peptidene ble holdt tilbake av iST-filteret. Til slutt ble peptidene vasket, eluert, tørket og resolubilisert i 20 ul injeksjonsbuffer (3 % acetonitril, 0,1 % maursyre).

Væskekromatografi-massespektrometri analyse

Massespektrometrianalyse ble utført på et Q Exactive HF-X massespektrometer (Thermo Scientific) utstyrt med en Digital PicoView-kilde (New Objective) og koblet til en M-klasse UPLC (Waters). Løsemiddelsammensetningen ved de to kanalene var 0,1 % maursyre for kanal A og 0,1 % maursyre, 99,9 % acetonitril for kanal B. For hver prøve ble 2 μL peptider lastet på en kommersiell MZ Symmetry C18 Trap Column (100Å, 5 µm) , 180 µm x 20 mm, Waters) etterfulgt av nanoEase MZ C18 HSS T3 Column (100Å, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). Peptidene ble eluert med en strømningshastighet på 300 nL/min med en gradient fra 8 til 27 % B i 85 minutter, 35 % B i 5 minutter og 80 % B i 1 min. Prøver ble innhentet i en randomisert rekkefølge. Massespektrometeret ble operert i dataavhengig modus (DDA), og oppnådde et fullskannings MS-spektra (350 - 1'400 m/z) med en oppløsning på 120'000 ved 200 m/z etter akkumulering til en målverdi på 3'000'000, etterfulgt av HCD-fragmentering (higher-energy collision dissociation) på de tjue mest intense signalene per syklus. HCD-spektra ble oppnådd med en oppløsning på 15.000 ved bruk av en normalisert kollisjonsenergi på 28 og en maksimal injeksjonstid på 22 ms. Den automatiske forsterkningskontrollen (AGC) ble satt til 100 000 ioner. Kontroll av ladetilstand ble aktivert. Enkelt-, ikke-tildelte og belastningstilstander høyere enn syv ble avvist. Kun forløpere med intensitet over 250 000 ble valgt for MS/MS. Forløpermasser som tidligere er valgt for MS/MS-måling ble ekskludert fra videre seleksjon i 30 s, og eksklusjonsvinduet ble satt til 10 ppm. Prøvene ble innhentet ved hjelp av intern låsemassekalibrering på m/z 371.1012 og 445.1200.

Proteinidentifikasjon og kvantifisering

De innhentede rå MS-dataene ble behandlet av MaxQuant (versjon 1.6.2.3), etterfulgt av proteinidentifikasjon ved hjelp av den integrerte Andromeda-søkemotoren. Analysen ble kjørt på det lokale laboratorieinformasjonsstyringssystemet (LIMS). Spektra ble søkt mot en database som inneholder Uniprot human reference proteome (taksonomi 9606, kanonisk versjon fra 20180703) og Human oral Microbiome Database (http://www.homd.org/, versjonsannoterte genomer 460+, 20180702), sammenkoblet til deres omvendte lokkede fasta-database og vanlige proteinforurensninger. Karbamidometylering av cystein ble satt som fast modifikasjon, mens metioninoksidasjon og N-terminal proteinacetylering ble satt som variable. Enzymspesifisitet ble satt til trypsin/P, noe som tillot en minimal peptidlengde på 7 aminosyrer og maksimalt to savnede spaltninger. MaxQuant Orbitrap standard søkeinnstillinger ble brukt. Maksimal falsk oppdagelsesrate (FDR) ble satt til 0,01 for peptider og 0,05 for proteiner. LFQ ble aktivert og et to-minutters vindu for kamper mellom løpene ble brukt. I den eksperimentelle designmalen MaxQuant holdes hver fil separat i det eksperimentelle designet for å oppnå individuelle kvantitative verdier.

Proteinintensitet og regulering

Et sett med R-funksjoner implementert i R-pakken prolfqua ble brukt til å utføre differensialekspresjonsanalysen. Peptidintensitetene rapportert av MaxQuant ble log2-transformert og deretter z-transformert slik at prøvegjennomsnittene og variansene var like. Deretter ble normaliserte proteinintensiteter estimert fra peptidintensitetene ved bruk av Tukeys medianpolering. Protein log2-fold endringer ble beregnet basert på normaliserte proteinintensiteter. En lineær modell med to faktorer (tid og pasient) ble tilpasset hvert protein, og gruppeforskjeller ble estimert og testet basert på modellparametrene. Variansestimatene ble moderert ved å bruke den empiriske Bayes-tilnærmingen, som utnytter den parallelle strukturen til eksperimentet med høy gjennomstrømning, som øker den statistiske kraften til Null-hypotesens signifikanstest. Til slutt ble p-verdiene justert ved å bruke Benjamini og Hochberg-prosedyren for å oppnå FDR-ene. Differensielt regulerte proteiner mellom tidspunktene (T1 vs T0, T6 vs T0 og T6 vs T1) ble vurdert ved FDR <0,05. Hovedkomponentanalyse ble utført for visualiseringsformål ved å bruke R-funksjonen 'prcomp'.

Baneanalyse

Differensielt regulerte humane proteiner (FDR <0,05) ble videre utsatt for QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA)-applikasjonen (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) for å undersøke hvilke sykdommer og biologiske prosesser som ble påvirket av regulatoriske endringer i vårt proteomdatasett. Analysen er basert på forventede årsakseffekter mellom regulerte proteiner og assosierte sykdommer eller funksjoner. IPA er et kraftig bioinformatisk analyseverktøy, basert på QIAGENs kunnskapsbase som kombinerer vitenskapelig og biomedisinsk informasjon fra tidsskriftartikler og databaser, som gir mulighet for tolkning av et bredt spekter av omics-uttrykksdata og spådommer om potensielle regulatoriske nettverk og årsakssammenhenger. En kjerneanalyse ble utført 12. april 2022 basert på log2-fold endring og FDR-data for T1 vs T0 og T6 vs T0, og de toppregulerte sykdommene og biologiske prosessene rangert etter FDR ble identifisert. Videre ble en z-score prediksjonsalgoritme brukt og sykdom eller funksjonelle aktiviteter ble kategorisert som signifikant økt (positive z-score) eller redusert (negative z-score) for z-score på henholdsvis ≥2 eller ≤-2 og presentert som varmekart med forskjellige firkantstørrelser (FDR) og farger (z-score). Større firkanter indikerer en mer signifikant overlapping mellom de regulerte proteinene i datasettet og en spesifikk sykdom eller funksjon, mens kvadratiske farger gjenspeiler retningen for endring for en sykdom eller funksjon (oransje: økt, blått: redusert). Proteiner assosiert med en spesifikk sykdom eller funksjon ble presentert som nettverksdiagrammer som indikerer proteinfunksjon, proteinregulering (opp- eller nedregulert) og den forutsagte typen assosiasjon/interaksjon (indirekte eller direkte, aktivering eller hemming).

Statistisk analyse

Et sett med R-funksjoner implementert i R-pakken prolfqua ble brukt til å utføre differensialekspresjonsanalysen. Peptidintensitetene rapportert av MaxQuant ble log2-transformert og deretter z-transformert slik at prøvegjennomsnittene og variansene var like. Deretter ble normaliserte proteinintensiteter estimert fra peptidintensitetene ved bruk av Tukeys medianpolering. Protein log2-fold endringer ble beregnet basert på normaliserte proteinintensiteter. En lineær modell med to faktorer (tid og pasient) ble tilpasset hvert protein, og gruppeforskjeller ble estimert og testet basert på modellparametrene. Variansestimatene ble moderert ved å bruke den empiriske Bayes-tilnærmingen, som utnytter den parallelle strukturen til eksperimentet med høy gjennomstrømning, som øker den statistiske kraften til Null-hypotesens signifikanstest. Til slutt ble p-verdiene justert ved å bruke Benjamini og Hochberg-prosedyren for å oppnå FDR-ene. Differensielt regulerte proteiner mellom tidspunktene (T1 vs T0, T6 vs T0 og T6 vs T1) ble vurdert ved FDR <0,05. Hovedkomponentanalyse ble utført for visualiseringsformål ved å bruke R-funksjonen 'prcomp'.