Proteoma salivare in risposta al trattamento parodontale non chirurgico

Popolazione in studio ed esame clinico

Un totale di 10 individui sistematicamente sani e non fumatori con parodontite di stadio III, grado C sono stati reclutati presso il Dipartimento di Parodontologia, Facoltà di Odontoiatria, Università Aydın Adnan Menderes, Aydın, Turchia.

La valutazione parodontale a bocca piena includeva misurazioni della profondità di sondaggio, perdita di attacco clinico, percentuale di siti con sanguinamento al sondaggio, indice gengivale e indice di placca al basale (T0) e un mese (T1) e sei mesi (T6) dopo il trattamento . Tutte le misurazioni sono state ottenute da 6 siti per dente esclusi i terzi molari utilizzando una sonda parodontale manuale (sonda parodontale di William, Hu-Friedy, Chicago, IL). Il riassorbimento osseo alveolare è stato valutato sulla radiografia panoramica digitale in ciascun partecipante. Tutte le misurazioni cliniche sono state eseguite da un parodontologo esperto (B.A.).

La diagnosi di parodontite di stadio III, grado C è stata eseguita secondo i criteri proposti dal Workshop internazionale 2017 sulla classificazione delle malattie e delle condizioni parodontali e perimplantari.

Trattamento

Il ridimensionamento convenzionale in base al quadrante e la levigatura radicolare (SRP) sono stati condotti al basale, dopo la raccolta della saliva e la valutazione parodontale, iniziando dal quadrante in alto a destra e continuando in senso orario per quattro visite a intervalli settimanali. La SRP è stata eseguita in anestesia locale dallo stesso parodontologo (B.A.) mediante l'utilizzo di strumenti ad ultrasuoni (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) e curette parodontali manuali (Gracey curets, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Tutti i denti presenti sono stati strumentati fino a quando la superficie della radice era visivamente e tattilmente pulita e liscia. Le misure di controllo della placca autoeseguite consistevano nello spazzolamento dei denti utilizzando la tecnica di Bass modificata con uno spazzolino medio e un normale dentifricio al fluoro due volte al giorno e la pulizia interdentale utilizzando il filo interdentale e/o gli spazzolini interdentali una volta al giorno. Il campionamento della saliva di follow-up e le valutazioni parodontali sono state eseguite a T1 e T6 dopo aver completato SRP.

Campionamento della saliva

La saliva intera non stimolata è stata ottenuta dai partecipanti la mattina tra le 8:00 e le 10:00 a T0, T1 e T6. A tutti i pazienti è stato chiesto di astenersi dal mangiare, dal bere e da tutte le procedure di igiene orale per 2 ore prima del campionamento. Ai pazienti è stato prima chiesto di sciacquarsi la bocca con acqua di rubinetto e di attendere 5 minuti per evitare la diluizione del campione. La saliva non stimolata è stata raccolta per un periodo di 5 minuti; i pazienti sono stati istruiti a sedersi con la testa inclinata in avanti per incoraggiare la salivazione passiva, espettorando in un tubo contenitore universale sterile in polipropilene. Dopo il campionamento, i campioni sono stati immediatamente trasferiti in celle frigorifere (4°C), aliquotati e congelati a -80°C fino al momento dell'uso.

Analisi proteomica quantitativa senza etichetta

I campioni di surnatante di saliva raccolti a T0, T1 e T6 (n = 30) sono stati analizzati utilizzando un approccio proteomico quantitativo senza etichetta (LFQ).

preparazione del campione

I campioni sono stati preparati utilizzando un kit iST commerciale (PreOmics, Germania) con una versione aggiornata del protocollo. La concentrazione proteica è stata stimata utilizzando il Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zurigo, Svizzera). Per ogni campione, 50 µg di proteine ​​sono stati trasferiti nella cartuccia e digeriti aggiungendo 50 µL della soluzione "Digest". Dopo 60 minuti di incubazione a 37°C la digestione è stata interrotta con 100 µL di Stop solution. Le soluzioni nella cartuccia sono state rimosse mediante centrifugazione a 3800 g, mentre i peptidi sono stati trattenuti dal filtro iST. Infine, i peptidi sono stati lavati, eluiti, essiccati e risolubilizzati in 20 µL di tampone di iniezione (3% acetonitrile, 0,1% acido formico).

Analisi cromatografia liquida-spettrometria di massa

L'analisi di spettrometria di massa è stata eseguita su uno spettrometro di massa Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) dotato di una sorgente Digital PicoView (New Objective) e accoppiato a un UPLC M-Class (Waters). La composizione del solvente nei due canali era 0,1% di acido formico per il canale A e 0,1% di acido formico, 99,9% di acetonitrile per il canale B. Per ciascun campione, 2 μL di peptidi sono stati caricati su una colonna trappola commerciale MZ Symmetry C18 (100Å, 5 µm , 180 µm x 20 mm, Waters) seguita dalla colonna nanoEase MZ C18 HSS T3 (100Å, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). I peptidi sono stati eluiti a una portata di 300 nL/min con un gradiente dall'8 al 27% B in 85 min, 35% B in 5 min e 80% B in 1 min. I campioni sono stati acquisiti in ordine randomizzato. Lo spettrometro di massa è stato utilizzato in modalità dipendente dai dati (DDA), acquisendo uno spettro MS a scansione completa (350 - 1'400 m/z) con una risoluzione di 120'000 a 200 m/z dopo l'accumulo fino a un valore target di 3'000'000, seguita dalla frammentazione HCD (higher-energy collision dissociation) sui venti segnali più intensi per ciclo. Gli spettri HCD sono stati acquisiti con una risoluzione di 15'000 utilizzando un'energia di collisione normalizzata di 28 e un tempo di iniezione massimo di 22 ms. Il controllo automatico del guadagno (AGC) è stato impostato su 100'000 ioni. Lo screening dello stato di carica è stato abilitato. Gli stati singoli, non assegnati e di addebito superiori a sette sono stati respinti. Solo i precursori con intensità superiore a 250'000 sono stati selezionati per MS/MS. Le masse precursori precedentemente selezionate per la misurazione MS/MS sono state escluse da un'ulteriore selezione per 30 s e la finestra di esclusione è stata impostata a 10 ppm. I campioni sono stati acquisiti utilizzando la calibrazione della massa di blocco interna su m/z 371.1012 e 445.1200.

Identificazione e quantificazione delle proteine

I dati MS grezzi acquisiti sono stati elaborati da MaxQuant (versione 1.6.2.3), seguita dall'identificazione delle proteine ​​utilizzando il motore di ricerca Andromeda integrato. L'analisi è stata eseguita sul sistema di gestione delle informazioni di laboratorio locale (LIMS). Gli spettri sono stati cercati in un database contenente il proteoma di riferimento umano Uniprot (tassonomia 9606, versione canonica da 20180703) e il database del microbioma orale umano (//www.homd.org/, versione annotated genomas 460+, 20180702), concatenati al loro database fasta decoyed invertito e contaminanti proteici comuni. La carbammidometilazione della cisteina è stata impostata come modifica fissa, mentre l'ossidazione della metionina e l'acetilazione della proteina N-terminale sono state impostate come variabili. La specificità enzimatica è stata impostata su tripsina/P, consentendo una lunghezza minima del peptide di 7 aminoacidi e un massimo di due scissioni mancate. Sono state utilizzate le impostazioni di ricerca predefinite di MaxQuant Orbitrap. Il tasso massimo di false scoperte (FDR) è stato impostato su 0,01 per i peptidi e 0,05 per le proteine. LFQ è stato abilitato ed è stata applicata una finestra di due minuti per le corrispondenze tra le esecuzioni. Nel modello di disegno sperimentale MaxQuant, ogni file viene tenuto separato nel disegno sperimentale per ottenere valori quantitativi individuali.

Intensità e regolazione delle proteine

Un insieme di funzioni R implementate nel pacchetto R prolfqua è stato utilizzato per eseguire l'analisi dell'espressione differenziale. Le intensità del peptide riportate da MaxQuant sono state trasformate log2 e quindi trasformate z in modo che le medie e le varianze del campione fossero uguali. Successivamente, le intensità proteiche normalizzate sono state stimate dalle intensità del peptide utilizzando la lucidatura mediana di Tukey. I cambiamenti delle proteine ​​​​log2 volte sono stati calcolati sulla base di intensità proteiche normalizzate. Un modello lineare con due fattori (tempo e paziente) è stato adattato a ciascuna proteina e le differenze di gruppo sono state stimate e testate in base ai parametri del modello. Le stime della varianza sono state moderate utilizzando l'approccio empirico di Bayes, che sfrutta la struttura parallela dell'esperimento ad alto rendimento, che aumenta la potenza statistica del test di significatività dell'ipotesi Null. Infine, i valori p sono stati aggiustati utilizzando la procedura Benjamini e Hochberg per ottenere i FDR. Le proteine ​​​​regolate in modo differenziale tra i punti temporali (T1 vs T0, T6 vs T0 e T6 vs T1) sono state considerate a FDR <0, 05. L'analisi dei componenti principali è stata eseguita per scopi di visualizzazione utilizzando la funzione R 'prcomp'.

Analisi del percorso

Le proteine ​​umane regolate in modo differenziale (FDR <0,05) sono state ulteriormente sottoposte all'applicazione QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) per indagare su quali malattie e processi biologici fossero influenzati dalla regolazione cambiamenti nel nostro set di dati sul proteoma. L'analisi si basa sugli effetti causali attesi tra proteine ​​regolate e malattie o funzioni associate. L'IPA è un potente strumento di analisi bioinformatica, basato sulla Knowledge Base di QIAGEN che combina informazioni scientifiche e biomediche da articoli di riviste e database, che consente l'interpretazione di un'ampia gamma di dati di espressione omica e previsioni di potenziali reti regolatorie e relazioni causali. Il 12 aprile 2022 è stata eseguita un'analisi di base sulla base della variazione log2 volte e dei dati FDR per T1 rispetto a T0 e T6 rispetto a T0 e sono stati identificati i principali processi regolati di malattia e biologici classificati in base a FDR. Inoltre, è stato applicato un algoritmo di previsione del punteggio z e le attività di malattia o funzionali sono state classificate come significativamente aumentate (punteggi z positivi) o diminuite (punteggi z negativi) per punteggi z di ≥2 o ≤-2, rispettivamente e presentate come mappe di calore con diverse dimensioni dei quadrati (FDR) e colori (z-punteggi). I quadrati più grandi indicano una sovrapposizione più significativa tra le proteine ​​regolate nel set di dati e una specifica malattia o funzione, mentre i colori dei quadrati riflettono la direzione del cambiamento per una malattia o funzione (arancione: aumento, blu: diminuzione). Le proteine ​​associate a una specifica malattia o funzione sono state presentate come grafici di rete che indicano la funzione proteica, la regolazione proteica (regolata verso l'alto o verso il basso) e il tipo previsto di associazione/interazione (indiretta o diretta, attivazione o inibizione).

Analisi statistica

Un insieme di funzioni R implementate nel pacchetto R prolfqua è stato utilizzato per eseguire l'analisi dell'espressione differenziale. Le intensità del peptide riportate da MaxQuant sono state trasformate log2 e quindi trasformate z in modo che le medie e le varianze del campione fossero uguali. Successivamente, le intensità proteiche normalizzate sono state stimate dalle intensità del peptide utilizzando la lucidatura mediana di Tukey. I cambiamenti delle proteine ​​​​log2 volte sono stati calcolati sulla base di intensità proteiche normalizzate. Un modello lineare con due fattori (tempo e paziente) è stato adattato a ciascuna proteina e le differenze di gruppo sono state stimate e testate in base ai parametri del modello. Le stime della varianza sono state moderate utilizzando l'approccio empirico di Bayes, che sfrutta la struttura parallela dell'esperimento ad alto rendimento, che aumenta la potenza statistica del test di significatività dell'ipotesi Null. Infine, i valori p sono stati aggiustati utilizzando la procedura Benjamini e Hochberg per ottenere i FDR. Le proteine ​​​​regolate in modo differenziale tra i punti temporali (T1 vs T0, T6 vs T0 e T6 vs T1) sono state considerate a FDR <0, 05. L'analisi dei componenti principali è stata eseguita per scopi di visualizzazione utilizzando la funzione R 'prcomp'.