Speekselproteoom als reactie op niet-chirurgische parodontale behandeling

Studiepopulatie en klinisch onderzoek

Een totaal van 10 systemisch gezonde en niet-rokers personen met stadium III, graad C parodontitis werden aangeworven bij de afdeling Parodontologie, School of Dentistry, Aydın Adnan Menderes University, Aydın, Turkije.

Parodontale beoordeling van de volledige mond omvatte metingen van sondediepte, verlies van klinische hechting, het percentage plaatsen met bloeding bij sonderen, tandvleesindex en plaque-index bij aanvang (T0) en één maand (T1) en zes maanden (T6) na de behandeling . Alle metingen werden verkregen van 6 locaties per tand, exclusief derde molaren, met behulp van een handmatige parodontale sonde (William's parodontale sonde, Hu-Friedy, Chicago, IL). De alveolaire botresorptie werd bij elke deelnemer beoordeeld op de digitale panoramische röntgenfoto. Alle klinische metingen werden uitgevoerd door een ervaren parodontoloog (B.A.).

Diagnose van stadium III, graad C parodontitis werd uitgevoerd volgens de criteria voorgesteld door de 2017 International Workshop on the Classification of Periodontal and Peri-implant Diseases and Conditions.

Behandeling

Conventionele kwadrantgewijze schaling en wortelplanering (SRP) werd uitgevoerd bij baseline, na speekselverzameling en parodontale beoordeling, beginnend met het kwadrant rechtsboven en met de klok mee voortgezet gedurende vier bezoeken met tussenpozen van een week. SRP werd uitgevoerd onder lokale anesthesie door dezelfde parodontoloog (B.A.) met behulp van ultrasone instrumenten (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) en manuele parodontale curettes (Gracey curets, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Alle aanwezige tanden werden geïnstrumenteerd totdat het worteloppervlak visueel en tactiel schoon en glad was. Zelf uitgevoerde plaquecontrolemaatregelen bestonden uit tweemaal daags poetsen met de gemodificeerde Bass-techniek met een middelgrote tandenborstel en een gewone tandpasta met fluoride en eenmaal daags interdentale reiniging met flosdraad en/of interdentale ragers. Follow-up speekselafname en parodontale beoordelingen werden uitgevoerd op T1 en T6 na het voltooien van SRP.

Speeksel bemonstering

Ongestimuleerd volledig speeksel werd 's ochtends tussen 8.00 en 10.00 uur op T0, T1 en T6 van de deelnemers verkregen. Alle patiënten werd verzocht zich gedurende 2 uur voorafgaand aan de bemonstering te onthouden van eten, drinken en alle mondhygiëneprocedures. Patiënten werd eerst gevraagd hun mond te spoelen met kraanwater en 5 minuten te wachten om verdunning van het monster te voorkomen. Ongestimuleerd speeksel werd gedurende een periode van 5 minuten verzameld; patiënten kregen de instructie om met hun hoofd naar voren gekanteld te zitten om passief kwijlen aan te moedigen, ophoestend in een steriele universele polypropyleen containerbuis. Na bemonstering werden de monsters onmiddellijk overgebracht naar een gekoelde opslag (4 °C), verdeeld in porties en ingevroren bij -80 °C totdat ze nodig waren.

Labelvrije kwantitatieve proteomische analyse

Speekselsupernatantmonsters verzameld op T0, T1 en T6 (n = 30) werden geanalyseerd met behulp van een labelvrije kwantitatieve (LFQ) proteomische benadering.

Voorbereiding van het monster

Monsters werden bereid met behulp van een commerciële iST Kit (PreOmics, Duitsland) met een bijgewerkte versie van het protocol. De eiwitconcentratie werd geschat met behulp van de Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zürich, Zwitserland). Voor elk monster werd 50 µg eiwit overgebracht naar de patroon en verteerd door toevoeging van 50 µl van de 'Digest'-oplossing. Na 60 minuten incubatie bij 37°C werd de digestie gestopt met 100 µL Stop-oplossing. De oplossingen in de cartridge werden verwijderd door centrifugatie bij 3800 g, terwijl de peptiden werden vastgehouden door het iST-filter. Ten slotte werden de peptiden gewassen, geëlueerd, gedroogd en opnieuw opgelost in 20 µl injectiebuffer (3% acetonitril, 0,1% mierenzuur).

Vloeistofchromatografie-massaspectrometrische analyse

Massaspectrometrie-analyse werd uitgevoerd op een Q Exactive HF-X massaspectrometer (Thermo Scientific) uitgerust met een Digital PicoView-bron (New Objective) en gekoppeld aan een M-Class UPLC (Waters). De oplosmiddelsamenstelling bij de twee kanalen was 0,1% mierenzuur voor kanaal A en 0,1% mierenzuur, 99,9% acetonitril voor kanaal B. Voor elk monster werd 2 μl peptiden geladen op een commerciële MZ Symmetry C18 Trap Column (100 A, 5 µm , 180 µm x 20 mm, water) gevolgd door nanoEase MZ C18 HSS T3-kolom (100 A, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, water). De peptiden werden geëlueerd met een stroomsnelheid van 300 nL/min met een gradiënt van 8 tot 27% B in 85 minuten, 35% B in 5 minuten en 80% B in 1 minuut. Monsters werden verkregen in een willekeurige volgorde. De massaspectrometer werd gebruikt in data-afhankelijke modus (DDA), waarbij MS-spectra met volledige scan (350 - 1.400 m/z) werden verkregen met een resolutie van 120.000 bij 200 m/z na accumulatie tot een doelwaarde van 3.000.000, gevolgd door HCD (higher-energy collision dissociation) fragmentatie op de twintig meest intense signalen per cyclus. HCD-spectra werden verkregen met een resolutie van 15.000 met behulp van een genormaliseerde botsingsenergie van 28 en een maximale injectietijd van 22 ms. De automatische versterkingsregeling (AGC) was ingesteld op 100.000 ionen. Laadstatusscreening was ingeschakeld. Afzonderlijk, niet-toegewezen en ladingstoestanden hoger dan zeven werden afgewezen. Alleen voorlopers met een intensiteit van meer dan 250.000 werden geselecteerd voor MS/MS. Precursormassa's die eerder waren geselecteerd voor MS/MS-meting, werden gedurende 30 seconden uitgesloten van verdere selectie en het uitsluitingsvenster werd ingesteld op 10 ppm. De monsters zijn verkregen met behulp van interne vergrendelingsmassakalibratie op m/z 371.1012 en 445.1200.

Identificatie en kwantificering van eiwitten

De verkregen onbewerkte MS-gegevens werden verwerkt door MaxQuant (versie 1.6.2.3), gevolgd door eiwitidentificatie met behulp van de geïntegreerde Andromeda-zoekmachine. De analyse werd uitgevoerd op het lokale laboratoriuminformatiebeheersysteem (LIMS). Spectra werden doorzocht aan de hand van een database met het Uniprot menselijke referentieproteoom (taxonomie 9606, canonieke versie vanaf 20180703) en de Human oral Microbiome Database (//www.homd.org/, versie geannoteerde genomen 460+, 20180702), aaneengeschakeld met hun omgekeerde misleidende fasta-database en algemene eiwitverontreinigingen. Carbamidomethylering van cysteïne werd ingesteld als vaste modificatie, terwijl methionine-oxidatie en N-terminale eiwitacetylering werden ingesteld als variabel. De enzymspecificiteit was ingesteld op trypsine/P, waardoor een minimale peptidelengte van 7 aminozuren en maximaal twee gemiste splitsingen mogelijk was. MaxQuant Orbitrap standaard zoekinstellingen werden gebruikt. De maximale valse ontdekkingssnelheid (FDR) was vastgesteld op 0,01 voor peptiden en 0,05 voor eiwitten. LFQ was ingeschakeld en er werd een venster van twee minuten toegepast voor wedstrijden tussen runs. In de experimentele ontwerpsjabloon van MaxQuant wordt elk bestand gescheiden gehouden in de experimentele opzet om individuele kwantitatieve waarden te verkrijgen.

Eiwitintensiteiten en regulatie

Een set R-functies geïmplementeerd in het R-pakket prolfqua werd gebruikt om de differentiële expressie-analyse uit te voeren. De door MaxQuant gerapporteerde peptide-intensiteiten werden log2-getransformeerd en vervolgens z-getransformeerd zodat de steekproefgemiddelden en varianties gelijk waren. Vervolgens werden genormaliseerde eiwitintensiteiten geschat op basis van de peptide-intensiteiten met behulp van Tukey's mediaan polish. Eiwit-log2-voudige veranderingen werden berekend op basis van genormaliseerde eiwitintensiteiten. Een lineair model met twee factoren (tijd en patiënt) werd op elk eiwit gepast en groepsverschillen werden geschat en getest op basis van de modelparameters. De variantieschattingen werden gemodereerd met behulp van de empirische Bayes-benadering, die gebruik maakt van de parallelle structuur van het high-throughput-experiment, wat de statistische kracht van de nulhypothese-significantietest vergroot. Ten slotte werden de p-waarden aangepast met behulp van de Benjamini- en Hochberg-procedure om de FDR's te verkrijgen. Differentieel gereguleerde eiwitten tussen de tijdstippen (T1 versus T0, T6 versus T0 en T6 versus T1) werden overwogen bij FDR <0,05. Principale componentenanalyse werd uitgevoerd voor visualisatiedoeleinden met behulp van de R-functie 'prcomp'.

Pathway-analyse

Differentieel gereguleerde menselijke eiwitten (FDR <0,05) werden verder onderworpen aan de toepassing QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) om te onderzoeken welke ziekten en biologische processen werden beïnvloed door regelgeving veranderingen in onze proteoom-dataset. De analyse is gebaseerd op verwachte causale effecten tussen gereguleerde eiwitten en geassocieerde ziekten of functies. IPA is een krachtige tool voor bio-informatica-analyse, gebaseerd op QIAGEN's Knowledge Base die wetenschappelijke en biomedische informatie combineert uit tijdschriftartikelen en databases, die interpretatie mogelijk maakt van een breed scala aan omics-expressiegegevens en voorspellingen van potentiële regulerende netwerken en oorzakelijke verbanden. Op 12 april 2022 werd een kernanalyse uitgevoerd op basis van log2-voudige verandering en FDR-gegevens voor T1 versus T0 en T6 versus T0, en de best gereguleerde ziekte en biologische processen gerangschikt volgens FDR werden geïdentificeerd. Verder werd een z-score voorspellingsalgoritme toegepast en werden ziekte of functionele activiteiten gecategoriseerd als significant toegenomen (positieve z-scores) of afgenomen (negatieve z-scores) voor z-scores van respectievelijk ≥2 of ≤-2 en gepresenteerd als heatmaps met verschillende vierkante formaten (FDR) en kleuren (z-scores). Grotere vierkanten duiden op een significantere overlap tussen de gereguleerde eiwitten in de dataset en een specifieke ziekte of functie, terwijl vierkante kleuren de veranderingsrichting voor een ziekte of functie weergeven (oranje: toegenomen, blauw: verminderd). Eiwitten geassocieerd met een specifieke ziekte of functie werden gepresenteerd als netwerkdiagrammen die de eiwitfunctie, eiwitregulatie (opwaarts of neerwaarts gereguleerd) en het voorspelde type associatie/interactie (indirect of direct, activering of remming) aangeven.

Statistische analyse

Een set R-functies geïmplementeerd in het R-pakket prolfqua werd gebruikt om de differentiële expressie-analyse uit te voeren. De door MaxQuant gerapporteerde peptide-intensiteiten werden log2-getransformeerd en vervolgens z-getransformeerd zodat de steekproefgemiddelden en varianties gelijk waren. Vervolgens werden genormaliseerde eiwitintensiteiten geschat op basis van de peptide-intensiteiten met behulp van Tukey's mediaan polish. Eiwit-log2-voudige veranderingen werden berekend op basis van genormaliseerde eiwitintensiteiten. Een lineair model met twee factoren (tijd en patiënt) werd op elk eiwit gepast en groepsverschillen werden geschat en getest op basis van de modelparameters. De variantieschattingen werden gemodereerd met behulp van de empirische Bayes-benadering, die gebruik maakt van de parallelle structuur van het high-throughput-experiment, wat de statistische kracht van de nulhypothese-significantietest vergroot. Ten slotte werden de p-waarden aangepast met behulp van de Benjamini- en Hochberg-procedure om de FDR's te verkrijgen. Differentieel gereguleerde eiwitten tussen de tijdstippen (T1 versus T0, T6 versus T0 en T6 versus T1) werden overwogen bij FDR <0,05. Principale componentenanalyse werd uitgevoerd voor visualisatiedoeleinden met behulp van de R-functie 'prcomp'.