Protéome salivaire en réponse au traitement parodontal non chirurgical

Population étudiée et examen clinique

Un total de 10 personnes systémiquement en bonne santé et non-fumeurs atteintes de parodontite de stade III, grade C ont été recrutées au Département de parodontologie, École de médecine dentaire, Université Aydın Adnan Menderes, Aydın, Turquie.

L'évaluation parodontale complète comprenait des mesures de la profondeur de sondage, de la perte d'attache clinique, du pourcentage de sites présentant des saignements au sondage, de l'indice gingival et de l'indice de plaque au départ (T0) et un mois (T1) et six mois (T6) après le traitement . Toutes les mesures ont été obtenues à partir de 6 sites par dent à l'exclusion des troisièmes molaires à l'aide d'une sonde parodontale manuelle (sonde parodontale de William, Hu-Friedy, Chicago, IL). La résorption osseuse alvéolaire a été évaluée sur la radiographie panoramique numérique chez chaque participant. Toutes les mesures cliniques ont été effectuées par un parodontiste expérimenté (B.A.).

Le diagnostic de la parodontite de stade III, grade C a été réalisé selon les critères proposés par l'Atelier international de 2017 sur la classification des maladies et affections parodontales et péri-implantaires.

Traitement

Le détartrage et le surfaçage radiculaire (SRP) conventionnels par quadrant ont été effectués au départ, après le prélèvement de salive et l'évaluation parodontale, en commençant par le quadrant supérieur droit et en continuant dans le sens des aiguilles d'une montre sur quatre visites à intervalles hebdomadaires. La SRP a été réalisée sous anesthésie locale par le même parodontiste (B.A.) à l'aide d'instruments à ultrasons (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) et de curettes parodontales manuelles (curettes Gracey, détartreur Hu-Friedy, Chicago, IL). Toutes les dents présentes ont été instrumentées jusqu'à ce que la surface radiculaire soit visuellement et tactilement propre et lisse. Les mesures de contrôle de la plaque auto-réalisées consistaient en un brossage des dents utilisant la technique de Bass modifiée avec une brosse à dents moyenne et un dentifrice ordinaire au fluor deux fois par jour et un nettoyage interdentaire à l'aide de fil dentaire et/ou de brossettes interdentaires une fois par jour. Des prélèvements de salive et des évaluations parodontales de suivi ont été effectués à T1 et T6 après avoir terminé le SRP.

Prélèvement de salive

La salive entière non stimulée a été obtenue des participants le matin entre 8h00 et 10h00 à T0, T1 et T6. Il a été demandé à tous les patients de s'abstenir de manger, de boire et de toute procédure d'hygiène bucco-dentaire pendant 2 heures avant le prélèvement. Les patients ont d'abord été invités à se rincer la bouche avec de l'eau du robinet et à attendre 5 minutes pour éviter la dilution de l'échantillon. La salive non stimulée a été recueillie sur une période de 5 minutes ; les patients ont été invités à s'asseoir avec la tête inclinée vers l'avant pour encourager la bave passive, en crachant dans un tube de récipient universel stérile en polypropylène. Après l'échantillonnage, les échantillons ont été immédiatement transférés dans un stockage réfrigéré (4 ° C), aliquotés et congelés à -80 ° C jusqu'à ce qu'ils soient requis.

Analyse protéomique quantitative sans étiquette

Les échantillons de surnageant de salive prélevés à T0, T1 et T6 (n = 30) ont été analysés à l'aide d'une approche protéomique quantitative sans étiquette (LFQ).

La préparation des échantillons

Les échantillons ont été préparés en utilisant un kit iST commercial (PreOmics, Allemagne) avec une version mise à jour du protocole. La concentration en protéines a été estimée à l'aide du kit d'analyse de protéines Qubit® (Life Technologies, Zurich, Suisse). Pour chaque échantillon, 50 µg de protéines ont été transférés dans la cartouche et digérés en ajoutant 50 µL de la solution « Digest ». Après 60 minutes d'incubation à 37 °C, la digestion a été arrêtée avec 100 µL de solution Stop. Les solutions dans la cartouche ont été éliminées par centrifugation à 3800 g, tandis que les peptides ont été retenus par le filtre iST. Enfin, les peptides ont été lavés, élués, séchés et resolubilisés dans 20 µL de tampon d'injection (3 % d'acétonitrile, 0,1 % d'acide formique).

Analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse

L'analyse par spectrométrie de masse a été réalisée sur un spectromètre de masse Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) équipé d'une source Digital PicoView (New Objective) et couplé à un UPLC M-Class (Waters). La composition du solvant au niveau des deux canaux était de 0,1 % d'acide formique pour le canal A et de 0,1 % d'acide formique, 99,9 % d'acétonitrile pour le canal B. Pour chaque échantillon, 2 μL de peptides ont été chargés sur une colonne commerciale MZ Symmetry C18 Trap (100 Å, 5 µm , 180 µm x 20 mm, Waters) suivi de la colonne nanoEase MZ C18 HSS T3 (100 Å, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). Les peptides ont été élues à un débit de 300 nL/min par un gradient de 8 à 27% B en 85 min, 35% B en 5 min et 80% B en 1 min. Les échantillons ont été acquis dans un ordre aléatoire. Le spectromètre de masse a fonctionné en mode dépendant des données (DDA), acquérant un spectre MS à balayage complet (350 - 1'400 m/z) à une résolution de 120'000 à 200 m/z après accumulation à une valeur cible de 3'000'000, suivi d'une fragmentation HCD (dissociation de collision à haute énergie) sur les vingt signaux les plus intenses par cycle. Les spectres HCD ont été acquis à une résolution de 15'000 en utilisant une énergie de collision normalisée de 28 et un temps d'injection maximum de 22 ms. Le contrôle automatique de gain (AGC) a été réglé sur 100'000 ions. Le filtrage de l'état de charge a été activé. Seuls, non attribués et les états de charge supérieurs à sept ont été rejetés. Seuls les précurseurs d'intensité supérieure à 250'000 ont été sélectionnés pour MS/MS. Les masses précurseurs précédemment sélectionnées pour la mesure MS/MS ont été exclues de toute sélection supplémentaire pendant 30 s, et la fenêtre d'exclusion a été fixée à 10 ppm. Les échantillons ont été acquis à l'aide d'un étalonnage de masse à verrouillage interne sur m/z 371,1012 et 445,1200.

Identification et quantification des protéines

Les données MS brutes acquises ont été traitées par MaxQuant (version 1.6.2.3), suivies d'une identification des protéines à l'aide du moteur de recherche intégré Andromeda. L'analyse a été effectuée sur le système local de gestion des informations du laboratoire (LIMS). Les spectres ont été recherchés dans une base de données contenant le protéome de référence humain Uniprot (taxonomie 9606, version canonique de 20180703) et la base de données sur le microbiome oral humain (http://www.homd.org/, version génomes annotés 460+, 20180702), concaténés à leur base de données fasta leurrée inversée et aux contaminants protéiques courants. La carbamidométhylation de la cystéine a été définie comme modification fixe, tandis que l'oxydation de la méthionine et l'acétylation de la protéine N-terminale ont été définies comme variables. La spécificité enzymatique a été fixée à la trypsine/P, permettant une longueur minimale de peptide de 7 acides aminés et un maximum de deux clivages manqués. Les paramètres de recherche par défaut de MaxQuant Orbitrap ont été utilisés. Le taux maximal de fausses découvertes (FDR) a été fixé à 0,01 pour les peptides et à 0,05 pour les protéines. LFQ a été activé et une fenêtre de deux minutes pour les correspondances entre les exécutions a été appliquée. Dans le modèle de conception expérimentale MaxQuant, chaque fichier est séparé dans la conception expérimentale pour obtenir des valeurs quantitatives individuelles.

Intensités protéiques et régulation

Un ensemble de fonctions R implémentées dans le package R proolfqua a été utilisé pour effectuer l'analyse de l'expression différentielle. Les intensités de peptide rapportées par MaxQuant ont été transformées en log2, puis transformées en z, de sorte que les moyennes et les variances de l'échantillon étaient égales. Ensuite, les intensités protéiques normalisées ont été estimées à partir des intensités peptidiques en utilisant le polissage médian de Tukey. Les variations log2 des protéines ont été calculées sur la base des intensités protéiques normalisées. Un modèle linéaire à deux facteurs (temps et patient) a été adapté à chaque protéine, et les différences de groupe ont été estimées et testées sur la base des paramètres du modèle. Les estimations de la variance ont été modérées à l'aide de l'approche empirique de Bayes, qui exploite la structure parallèle de l'expérience à haut débit, ce qui augmente la puissance statistique du test de signification de l'hypothèse nulle. Enfin, les valeurs de p ont été ajustées à l'aide de la procédure de Benjamini et Hochberg pour obtenir les FDR. Les protéines différentiellement régulées entre les points temporels (T1 vs T0, T6 vs T0 et T6 vs T1) ont été considérées à FDR <0,05. L'analyse en composantes principales a été effectuée à des fins de visualisation à l'aide de la fonction R « prcomp ».

Analyse de la voie

Des protéines humaines à régulation différentielle (FDR <0,05) ont ensuite été soumises à l'application QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) pour déterminer quelles maladies et quels processus biologiques étaient affectés par la réglementation. changements dans notre ensemble de données sur les protéomes. L'analyse est basée sur les effets causals attendus entre les protéines régulées et les maladies ou fonctions associées. IPA est un puissant outil d'analyse bioinformatique, basé sur la base de connaissances de QIAGEN combinant des informations scientifiques et biomédicales provenant d'articles de revues et de bases de données, qui permet l'interprétation d'un large éventail de données d'expression omiques et de prédictions de réseaux de régulation potentiels et de relations causales. Une analyse de base a été effectuée le 12 avril 2022 sur la base du changement log2 et des données FDR pour T1 vs T0 et T6 vs T0, et les principales maladies réglementées et processus biologiques classés par FDR ont été identifiés. En outre, un algorithme de prédiction du score z a été appliqué et la maladie ou les activités fonctionnelles ont été classées comme significativement augmentées (scores z positifs) ou diminuées (scores z négatifs) pour les scores z ≥2 ou ≤-2, respectivement et présentées comme cartes thermiques avec différentes tailles de carrés (FDR) et couleurs (z-scores). Les carrés plus grands indiquent un chevauchement plus important entre les protéines régulées dans l'ensemble de données et une maladie ou une fonction spécifique, tandis que les couleurs des carrés reflètent la direction du changement pour une maladie ou une fonction (orange : augmenté, bleu : diminué). Les protéines associées à une maladie ou à une fonction spécifique ont été présentées sous forme de diagrammes en réseau indiquant la fonction des protéines, la régulation des protéines (régulée à la hausse ou à la baisse) et le type prévu d'association/d'interaction (indirecte ou directe, activation ou inhibition).

Analyses statistiques

Un ensemble de fonctions R implémentées dans le package R proolfqua a été utilisé pour effectuer l'analyse de l'expression différentielle. Les intensités de peptide rapportées par MaxQuant ont été transformées en log2, puis transformées en z, de sorte que les moyennes et les variances de l'échantillon étaient égales. Ensuite, les intensités protéiques normalisées ont été estimées à partir des intensités peptidiques en utilisant le polissage médian de Tukey. Les variations log2 des protéines ont été calculées sur la base des intensités protéiques normalisées. Un modèle linéaire à deux facteurs (temps et patient) a été adapté à chaque protéine, et les différences de groupe ont été estimées et testées sur la base des paramètres du modèle. Les estimations de la variance ont été modérées à l'aide de l'approche empirique de Bayes, qui exploite la structure parallèle de l'expérience à haut débit, ce qui augmente la puissance statistique du test de signification de l'hypothèse nulle. Enfin, les valeurs de p ont été ajustées à l'aide de la procédure de Benjamini et Hochberg pour obtenir les FDR. Les protéines différentiellement régulées entre les points temporels (T1 vs T0, T6 vs T0 et T6 vs T1) ont été considérées à FDR <0,05. L'analyse en composantes principales a été effectuée à des fins de visualisation à l'aide de la fonction R « prcomp ».