Протеом слюны в ответ на нехирургическое пародонтологическое лечение

Исследуемая популяция и клиническое обследование

В общей сложности 10 системно здоровых и некурящих лиц с периодонтитом III стадии, степени C были набраны на кафедре пародонтологии Школы стоматологии Университета Айдына Аднана Мендереса, Айдын, Турция.

Полная оценка состояния пародонта включала измерения глубины зондирования, потери клинического прикрепления, процент мест с кровоточивостью при зондировании, десневой индекс и индекс зубного налета на исходном уровне (T0), а также через один месяц (T1) и шесть месяцев (T6) после лечения. . Все измерения были получены с 6 участков на зуб, за исключением третьих моляров, с использованием ручного пародонтального зонда (пародонтальный зонд Уильяма, Hu-Friedy, Чикаго, Иллинойс). Резорбцию альвеолярной кости оценивали на цифровой панорамной рентгенограмме у каждого участника. Все клинические измерения проводились опытным пародонтологом (B.A.).

Диагностика периодонтита III стадии, степени С проводилась в соответствии с критериями, предложенными Международным семинаром по классификации пародонтальных и периимплантационных заболеваний и состояний 2017 года.

Уход

Обычный квадрантный скейлинг и полировку корней (SRP) проводили в начале исследования, после сбора слюны и оценки пародонта, начиная с верхнего правого квадранта и продолжая по часовой стрелке в течение четырех посещений с недельными интервалами. SRP был выполнен под местной анестезией тем же пародонтологом (BA) с использованием ультразвуковых инструментов (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) и ручных пародонтальных кюрет (Gracey curets, скалер Hu-Friedy, Чикаго, Иллинойс). Все имеющиеся зубы подвергались инструментальной обработке до тех пор, пока поверхность корня не стала визуально и тактильно чистой и гладкой. Самостоятельные меры по борьбе с зубным налетом включали чистку зубов по модифицированной методике Басса средней зубной щеткой и обычной зубной пастой с фтором два раза в день и чистку межзубных промежутков с использованием зубной нити и/или межзубных щеток один раз в день. Последующие пробы слюны и пародонтальные оценки были выполнены на Т1 и Т6 после завершения SRP.

Отбор проб слюны

Нестимулированная цельная слюна была получена у участников утром между 8:00 и 10:00 в Т0, Т1 и Т6. Всем пациентам было предложено воздержаться от еды, питья и любых процедур гигиены полости рта в течение 2 часов до забора проб. Пациентов сначала просили прополоскать рот водопроводной водой и подождать 5 минут, чтобы избежать разбавления образца. Нестимулированную слюну собирали в течение 5 минут; пациенты были проинструктированы сидеть, наклонив голову вперед, чтобы стимулировать пассивное слюнотечение, отхаркивая мокроту в стерильную универсальную полипропиленовую трубку-контейнер. После отбора образцы немедленно переносили в холодильное хранилище (4°C), делили на аликвоты и замораживали при -80°C до тех пор, пока они не понадобятся.

Безметочный количественный протеомный анализ

Образцы надосадочной жидкости слюны, собранные в T0, T1 и T6 (n = 30), были проанализированы с использованием количественного (LFQ) протеомного подхода без использования меток.

Базовые приготовления

Образцы готовили с использованием коммерческого набора iST Kit (PreOmics, Германия) с обновленной версией протокола. Концентрацию белка оценивали с помощью набора Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Цюрих, Швейцария). Для каждого образца 50 мкг белка переносили в картридж и расщепляли, добавляя 50 мкл раствора 'Digest'. После 60 минут инкубации при 37°С расщепление останавливали добавлением 100 мкл стоп-раствора. Растворы в картридже удаляли центрифугированием при 3800 g, а пептиды задерживали на iST-фильтре. Наконец, пептиды промывали, элюировали, сушили и повторно растворяли в 20 мкл буфера для инъекций (3% ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота).

Жидкостная хроматография-масс-спектрометрический анализ

Масс-спектрометрический анализ выполняли на масс-спектрометре Q Exactive HF-X (Thermo Scientific), оборудованном источником Digital PicoView (New Objective) и соединенным с UPLC M-класса (Waters). Состав растворителя для двух каналов: 0,1 % муравьиной кислоты для канала А и 0,1 % муравьиной кислоты, 99,9 % ацетонитрила для канала В. Для каждого образца 2 мкл пептидов загружали в коммерчески доступную колонку-ловушку MZ Symmetry C18 (100 Å, 5 мкм). , 180 мкм x 20 мм, Waters), а затем колонку nanoEase MZ C18 HSS T3 (100Å, 1,8 мкм, 75 мкм x 250 мм, Waters). Пептиды элюировали со скоростью потока 300 нл/мин с градиентом от 8 до 27% B за 85 мин, 35% B за 5 мин и 80% B за 1 мин. Образцы были получены в рандомизированном порядке. Масс-спектрометр работал в режиме зависимости от данных (DDA), получая спектры МС полного сканирования (350–1400 м/z) с разрешением 120 000 при 200 м/z после накопления до целевого значения 3 000 000, за которым следует фрагментация HCD (высокоэнергетическая столкновительная диссоциация) по двадцати наиболее интенсивным сигналам за цикл. Спектры HCD были получены с разрешением 15 000 с использованием нормализованной энергии столкновения 28 и максимального времени инжекции 22 мс. Автоматическая регулировка усиления (AGC) была установлена ​​на 100 000 ионов. Проверка состояния заряда включена. Одиночные, неназначенные и состояния заряда выше семи были отклонены. Для МС/МС отбирали только прекурсоры с интенсивностью выше 250 000. Массы прекурсоров, ранее выбранные для измерения МС/МС, исключали из дальнейшего отбора на 30 с, а окно исключения устанавливали на уровне 10 частей на миллион. Образцы были получены с использованием калибровки внутренней фиксирующей массы на m/z 371,1012 и 445,1200.

Идентификация и количественная оценка белков

Полученные необработанные данные MS были обработаны MaxQuant (версия 1.6.2.3) с последующей идентификацией белка с использованием интегрированной поисковой системы Andromeda. Анализ проводился в локальной системе управления лабораторной информацией (LIMS). Поиск спектров проводился в базе данных, содержащей эталонный протеом человека Uniprot (таксономия 9606, каноническая версия от 20180703) и в базе данных микробиома ротовой полости человека (http://www.homd.org/, версии аннотированных геномов 460+, 20180702), соединенных с их перевернутой базой данных фаста и обычными белковыми примесями. За фиксированную модификацию принимали карбамидометилирование цистеина, а за переменную - окисление метионина и ацетилирование N-концевого белка. Специфичность фермента была установлена ​​на трипсин/P, что допускало минимальную длину пептида 7 аминокислот и максимум два пропущенных расщепления. Использовались настройки поиска MaxQuant Orbitrap по умолчанию. Максимальный коэффициент ложного обнаружения (FDR) был установлен на уровне 0,01 для пептидов и 0,05 для белков. Был включен LFQ и применено двухминутное окно для совпадений между запусками. В шаблоне плана эксперимента MaxQuant каждый файл хранится отдельно в плане эксперимента для получения индивидуальных количественных значений.

Интенсивность белков и регулирование

Набор функций R, реализованных в пакете R prolfqua, использовался для выполнения дифференциального анализа выражений. Интенсивности пептидов, представленные MaxQuant, были преобразованы в log2, а затем в z-преобразование, чтобы средние значения и дисперсии выборки были равны. Затем нормализованные интенсивности белков оценивали по интенсивностям пептидов с использованием медианного полирования Тьюки. Логарифмические 2-кратные изменения белка рассчитывали на основе нормализованной интенсивности белка. Для каждого белка была подобрана линейная модель с двумя факторами (время и пациент), а групповые различия оценивались и тестировались на основе параметров модели. Оценки дисперсии были скорректированы с использованием эмпирического байесовского подхода, в котором используется параллельная структура эксперимента с высокой пропускной способностью, что увеличивает статистическую мощность теста значимости нулевой гипотезы. Наконец, значения p были скорректированы с использованием процедуры Бенджамини и Хохберга для получения FDR. Дифференциально регулируемые белки между временными точками (T1 по сравнению с T0, T6 по сравнению с T0 и T6 по сравнению с T1) рассматривались при FDR <0,05. Анализ основных компонентов был выполнен для целей визуализации с использованием R-функции 'prcomp'.

Анализ пути

Дифференциально регулируемые белки человека (FDR <0,05) были дополнительно подвергнуты анализу QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) для исследования того, на какие заболевания и биологические процессы влияют регуляторные механизмы. изменения в нашем наборе данных протеома. Анализ основан на ожидаемых причинно-следственных связях между регулируемыми белками и сопутствующими заболеваниями или функциями. IPA — это мощный инструмент биоинформатического анализа, основанный на базе знаний QIAGEN, объединяющий научную и биомедицинскую информацию из журнальных статей и баз данных, который позволяет интерпретировать широкий спектр данных об экспрессии омиков и прогнозировать потенциальные регуляторные сети и причинно-следственные связи. Базовый анализ был проведен 12 апреля 2022 года на основе логарифмического 2-кратного изменения и данных FDR для T1 по сравнению с T0 и T6 по сравнению с T0, и были определены наиболее регулируемые заболевания и биологические процессы, ранжированные по FDR. Кроме того, был применен алгоритм прогнозирования z-показателя, и заболевание или функциональная активность были классифицированы как значительно повышенные (положительные z-показатели) или сниженные (отрицательные z-показатели) для z-показателей ≥2 или ≤-2 соответственно и представлены в виде тепловые карты с разными размерами квадратов (FDR) и цветами (z-показатели). Квадраты большего размера указывают на более значительное перекрытие между регулируемыми белками в наборе данных и конкретным заболеванием или функцией, в то время как цвета квадратов отражают направление изменения заболевания или функции (оранжевый: увеличение, синий: снижение). Белки, связанные с конкретным заболеванием или функцией, были представлены в виде сетевых диаграмм, показывающих функцию белка, регуляцию белка (повышение или понижение) и прогнозируемый тип ассоциации/взаимодействия (непрямой или прямой, активация или ингибирование).

Статистический анализ

Набор функций R, реализованных в пакете R prolfqua, использовался для выполнения дифференциального анализа выражений. Интенсивности пептидов, представленные MaxQuant, были преобразованы в log2, а затем в z-преобразование, чтобы средние значения и дисперсии выборки были равны. Затем нормализованные интенсивности белков оценивали по интенсивностям пептидов с использованием медианного полирования Тьюки. Логарифмические 2-кратные изменения белка рассчитывали на основе нормализованной интенсивности белка. Для каждого белка была подобрана линейная модель с двумя факторами (время и пациент), а групповые различия оценивались и тестировались на основе параметров модели. Оценки дисперсии были скорректированы с использованием эмпирического байесовского подхода, в котором используется параллельная структура эксперимента с высокой пропускной способностью, что увеличивает статистическую мощность теста значимости нулевой гипотезы. Наконец, значения p были скорректированы с использованием процедуры Бенджамини и Хохберга для получения FDR. Дифференциально регулируемые белки между временными точками (T1 по сравнению с T0, T6 по сравнению с T0 и T6 по сравнению с T1) рассматривались при FDR <0,05. Анализ основных компонентов был выполнен для целей визуализации с использованием R-функции 'prcomp'.