Slinný proteom v reakci na nechirurgickou parodontální léčbu

Studijní populace a klinické vyšetření

Celkem 10 systémově zdravých a nekuřáků s parodontitidou stupně III stupně C bylo přijato na Klinice parodontologie Fakulty zubního lékařství Aydın Adnan Menderes University, Aydın, Turecko.

Periodontální vyšetření v celých ústech zahrnovalo měření hloubky sondování, klinické ztráty přilnutí, procenta míst s krvácením při sondování, index dásní a index plaku na začátku (T0) a jeden měsíc (T1) a šest měsíců (T6) po léčbě . Všechna měření byla získána ze 6 míst na zub s výjimkou třetích molárů za použití manuální periodontální sondy (Williamova periodontální sonda, Hu-Friedy, Chicago, IL). U každého účastníka byla na digitálním panoramatickém rentgenovém snímku hodnocena resorpce alveolární kosti. Všechna klinická měření prováděl zkušený parodontolog (B.A.).

Diagnostika parodontitidy stupně III stupně C byla provedena podle kritérií navržených v roce 2017 Mezinárodním workshopem o klasifikaci onemocnění a stavů parodontu a periimplantátu.

Léčba

Konvenční kvadrantové škálování a hoblování kořenů (SRP) bylo provedeno na začátku, po odběru slin a periodontálním vyšetření, počínaje horním pravým kvadrantem a pokračovat ve směru hodinových ručiček po čtyři návštěvy v týdenních intervalech. SRP byla provedena v lokální anestezii stejným parodontologem (B.A.) za použití ultrazvukových nástrojů (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) a manuálních parodontálních kyret (Gracey curets, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Všechny přítomné zuby byly instrumentovány, dokud povrch kořene nebyl vizuálně a hmatově čistý a hladký. Samostatně prováděná opatření pro kontrolu plaku spočívala v čištění zubů pomocí modifikované Bassovy techniky středním zubním kartáčkem a běžnou zubní pastou s fluorem dvakrát denně a čištění mezizubních prostor pomocí dentální nitě a/nebo mezizubních kartáčků jednou denně. Následné odběry slin a periodontální hodnocení byly provedeny v T1 a T6 po dokončení SRP.

Odběr slin

Nestimulované celé sliny byly od účastníků získány ráno mezi 8:00 - 10:00 v T0, T1 a T6. Všichni pacienti byli požádáni, aby se zdrželi jídla, pití a všech procedur ústní hygieny po dobu 2 hodin před odběrem vzorků. Pacienti byli nejprve požádáni, aby si vypláchli ústa vodou z vodovodu a počkali 5 minut, aby nedošlo k naředění vzorku. Nestimulované sliny byly odebírány po dobu 5 minut; pacienti byli instruováni, aby seděli s hlavou nakloněnou dopředu, aby se podpořilo pasivní slintání, vykašlávání do sterilní univerzální polypropylenové nádobky. Po odběru vzorků byly vzorky okamžitě přeneseny do chlazeného skladu (4 °C), rozděleny na alikvoty a zmraženy při -80 °C, dokud nebyly potřeba.

Kvantitativní proteomická analýza bez označení

Vzorky supernatantu slin odebrané v TO, T1 a T6 (n = 30) byly analyzovány pomocí kvantitativního (LFQ) proteomického přístupu bez značení.

příprava vzorků

Vzorky byly připraveny pomocí komerční sady iST (PreOmics, Německo) s aktualizovanou verzí protokolu. Koncentrace proteinu byla odhadnuta pomocí Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zurich, Švýcarsko). Pro každý vzorek bylo 50 ug proteinu přeneseno do kazety a štěpeno přidáním 50 ul roztoku 'Dgest'. Po 60 minutách inkubace při 37 °C bylo štěpení zastaveno 100 ul Stop roztoku. Roztoky v patroně byly odstraněny centrifugací při 3800 g, zatímco peptidy byly zadrženy iST-filtrem. Nakonec byly peptidy promyty, eluovány, sušeny a znovu solubilizovány ve 20 ul injekčního pufru (3% acetonitril, 0,1% kyselina mravenčí).

Kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie

Analýza hmotnostní spektrometrií byla provedena na hmotnostním spektrometru Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) vybaveném zdrojem Digital PicoView (New Objective) a připojeným k UPLC třídy M (Waters). Složení rozpouštědla na dvou kanálech bylo 0,1 % kyselina mravenčí pro kanál A a 0,1 % kyselina mravenčí, 99,9 % acetonitril pro kanál B. Pro každý vzorek byly 2 μl peptidů naneseny na komerční MZ Symmetry C18 Trap Column (100 Á, 5 um , 180 um x 20 mm, Waters) následovanou kolonou nanoEase MZ C18 HSS T3 (100 Á, 1,8 um, 75 um x 250 mm, Waters). Peptidy byly eluovány při průtoku 300 nL/min gradientem od 8 do 27 % B za 85 minut, 35 % B za 5 minut a 80 % B za 1 minutu. Vzorky byly získány v náhodném pořadí. Hmotnostní spektrometr pracoval v režimu závislém na datech (DDA) a získával MS spektra s úplným skenováním (350 - 1'400 m/z) při rozlišení 120 000 při 200 m/z po akumulaci na cílovou hodnotu 3'000'000, po které následuje fragmentace HCD (disociace kolize s vyšší energií) na dvaceti nejintenzivnějších signálech za cyklus. HCD spektra byla získána s rozlišením 15'000 za použití normalizované srážkové energie 28 a maximální doby nástřiku 22 ms. Automatické řízení zisku (AGC) bylo nastaveno na 100 000 iontů. Bylo povoleno sledování stavu nabití. Jednotlivé stavy, nepřiřazené a stavy nabití vyšší než sedm byly zamítnuty. Pro MS/MS byly vybrány pouze prekurzory s intenzitou nad 250 000. Prekurzorové hmoty dříve vybrané pro měření MS/MS byly vyloučeny z dalšího výběru na 30 s a okno vyloučení bylo nastaveno na 10 ppm. Vzorky byly získány za použití interní kalibrace hmotnosti na m/z 371,1012 a 445,1200.

Identifikace a kvantifikace bílkovin

Získaná nezpracovaná MS data byla zpracována pomocí MaxQuant (verze 1.6.2.3) s následnou identifikací proteinů pomocí integrovaného vyhledávače Andromeda. Analýza byla spuštěna na místním laboratorním informačním systému (LIMS). Spektra byla prohledána proti databázi obsahující lidský referenční proteom Uniprot (taxonomie 9606, kanonická verze z 20180703) a databázi lidských orálních mikrobiomů (http://www.homd.org/, verze anotované genomy 460+, 20180702), zřetězené do jejich reverzní databáze fasta a běžných proteinových kontaminantů. Karbamidomethylace cysteinu byla nastavena jako fixní modifikace, zatímco oxidace methioninu a acetylace N-terminálního proteinu byly nastaveny jako variabilní. Specifičnost enzymu byla nastavena na trypsin/P, což umožnilo minimální délku peptidu 7 aminokyselin a maximálně dvě chybějící štěpení. Bylo použito výchozí nastavení vyhledávání MaxQuant Orbitrap. Maximální míra falešného objevu (FDR) byla nastavena na 0,01 pro peptidy a 0,05 pro proteiny. Bylo povoleno LFQ a bylo použito dvouminutové okno pro zápasy mezi běhy. V šabloně návrhu experimentu MaxQuant je každý soubor v experimentálním návrhu uchováván odděleně, aby se získaly jednotlivé kvantitativní hodnoty.

Intenzity a regulace bílkovin

K provedení diferenciální expresní analýzy byla použita sada R funkcí implementovaných v R balíčku prolfqua. Intenzity peptidů uváděné pomocí MaxQuant byly log2-transformovány a poté z-transformovány tak, že průměry vzorků a variace byly stejné. Dále byly normalizované intenzity proteinů odhadnuty z intenzit peptidů pomocí Tukeyova středního lesku. Log2-násobné změny proteinu byly vypočteny na základě normalizovaných intenzit proteinů. Každému proteinu byl přizpůsoben lineární model se dvěma faktory (čas a pacient) a na základě parametrů modelu byly odhadnuty a testovány skupinové rozdíly. Odhady rozptylu byly moderovány pomocí empirického Bayesova přístupu, který využívá paralelní strukturu experimentu s vysokou propustností, což zvyšuje statistickou sílu testu významnosti nulové hypotézy. Nakonec byly p-hodnoty upraveny pomocí Benjaminiho a Hochbergova postupu, aby se získaly FDR. Diferenciálně regulované proteiny mezi časovými body (T1 vs TO, T6 vs TO a T6 vs T1) byly uvažovány při FDR <0,05. Analýza hlavních komponent byla provedena pro účely vizualizace pomocí R funkce 'prcomp'.

Analýza cesty

Diferenciálně regulované lidské proteiny (FDR <0,05) byly dále podrobeny aplikaci QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA), aby se zjistilo, které nemoci a biologické procesy byly ovlivněny regulačními změny v našem datovém souboru proteomu. Analýza je založena na očekávaných kauzálních účincích mezi regulovanými proteiny a přidruženými chorobami nebo funkcemi. IPA je výkonný bioinformatický analytický nástroj založený na znalostní bázi QIAGEN kombinující vědecké a biomedicínské informace z časopiseckých článků a databází, který umožňuje interpretaci široké škály dat omických výrazů a předpovědí potenciálních regulačních sítí a kauzálních vztahů. Základní analýza byla provedena 12. dubna 2022 na základě log2násobné změny a dat FDR pro T1 vs T0 a T6 vs T0 a byly identifikovány nejlépe regulované nemoci a biologické procesy seřazené podle FDR. Dále byl použit predikční algoritmus z-skóre a onemocnění nebo funkční aktivity byly kategorizovány jako významně zvýšené (pozitivní z-skóre) nebo snížené (negativní z-skóre) pro z-skóre ≥2 nebo ≤-2 a prezentovány jako teplotní mapy s různými velikostmi čtverců (FDR) a barvami (z-skóre). Větší čtverce indikují významnější překrývání mezi regulovanými proteiny v souboru dat a konkrétním onemocněním nebo funkcí, zatímco čtvercové barvy odrážejí směr změny onemocnění nebo funkce (oranžová: zvýšená, modrá: snížená). Proteiny spojené s konkrétním onemocněním nebo funkcí byly prezentovány jako síťové grafy indikující funkci proteinu, regulaci proteinu (regulovanou nahoru nebo dolů) a předpokládaný typ asociace/interakce (nepřímá nebo přímá, aktivace nebo inhibice).

Statistická analýza

K provedení diferenciální expresní analýzy byla použita sada R funkcí implementovaných v R balíčku prolfqua. Intenzity peptidů uváděné pomocí MaxQuant byly log2-transformovány a poté z-transformovány tak, že průměry vzorků a variace byly stejné. Dále byly normalizované intenzity proteinů odhadnuty z intenzit peptidů pomocí Tukeyova středního lesku. Log2-násobné změny proteinu byly vypočteny na základě normalizovaných intenzit proteinů. Každému proteinu byl přizpůsoben lineární model se dvěma faktory (čas a pacient) a na základě parametrů modelu byly odhadnuty a testovány skupinové rozdíly. Odhady rozptylu byly moderovány pomocí empirického Bayesova přístupu, který využívá paralelní strukturu experimentu s vysokou propustností, což zvyšuje statistickou sílu testu významnosti nulové hypotézy. Nakonec byly p-hodnoty upraveny pomocí Benjaminiho a Hochbergova postupu, aby se získaly FDR. Diferenciálně regulované proteiny mezi časovými body (T1 vs TO, T6 vs TO a T6 vs T1) byly uvažovány při FDR <0,05. Analýza hlavních komponent byla provedena pro účely vizualizace pomocí R funkce 'prcomp'.