Proteoma Salivar em Resposta ao Tratamento Periodontal Não Cirúrgico

População do Estudo e Exame Clínico

Um total de 10 indivíduos sistemicamente saudáveis ​​e não fumantes com estágio III, periodontite grau C foram recrutados no Departamento de Periodontologia, Escola de Odontologia, Aydın Adnan Menderes University, Aydın, Turquia.

A avaliação periodontal de boca inteira incluiu medidas de profundidade de sondagem, perda de inserção clínica, porcentagem de locais com sangramento à sondagem, índice gengival e índice de placa no início (T0) e um mês (T1) e seis meses (T6) pós-tratamento . Todas as medições foram obtidas de 6 locais por dente, excluindo terceiros molares, usando uma sonda periodontal manual (sonda periodontal de William, Hu-Friedy, Chicago, IL). A reabsorção óssea alveolar foi avaliada na radiografia panorâmica digital em cada participante. Todas as medições clínicas foram realizadas por um periodontista experiente (B.A.).

O diagnóstico de periodontite grau C, estágio III, foi realizado de acordo com os critérios propostos pelo Workshop Internacional de 2017 sobre a Classificação de Doenças e Condições Periodontais e Peri-implantares.

Tratamento

Raspagem quadrante convencional e alisamento radicular (SRP) foram conduzidos no início, após a coleta de saliva e avaliação periodontal, começando com o quadrante superior direito e continuando no sentido horário ao longo de quatro visitas em intervalos semanais. A SRP foi realizada sob anestesia local pelo mesmo periodontista (B.A.) por meio de instrumentos ultrassônicos (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) e curetas periodontais manuais (curetas Gracey, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Todos os dentes presentes foram instrumentados até que a superfície radicular estivesse visualmente e tatilmente limpa e lisa. As medidas de controle de placa auto-realizadas consistiram em escovação dentária usando a técnica de Bass modificada com uma escova de dentes média e um creme dental regular com flúor duas vezes ao dia e limpeza interdental usando fio dental e/ou escovas interdentais uma vez ao dia. Amostras de saliva de acompanhamento e avaliações periodontais foram realizadas em T1 e T6 após a conclusão do SRP.

Amostragem de saliva

A saliva total não estimulada foi obtida dos participantes no período da manhã entre 8h00 e 10h00 em T0, T1 e T6. Todos os pacientes foram solicitados a se abster de comer, beber e todos os procedimentos de higiene oral por 2 horas antes da amostragem. Os pacientes foram inicialmente orientados a enxaguar a boca com água corrente e aguardar 5 minutos para evitar a diluição da amostra. A saliva não estimulada foi coletada durante um período de 5 minutos; os pacientes foram instruídos a sentar com a cabeça inclinada para frente para estimular a salivação passiva, expectorando em um tubo recipiente de polipropileno universal estéril. Após a amostragem, as amostras foram imediatamente transferidas para armazenamento refrigerado (4 °C), aliquotadas e congeladas a -80 °C até serem necessárias.

Análise proteômica quantitativa sem rótulo

Amostras de sobrenadante de saliva coletadas em T0, T1 e T6 (n = 30) foram analisadas usando uma abordagem proteômica quantitativa livre de marcação (LFQ).

Preparação de amostra

As amostras foram preparadas usando um Kit iST comercial (PreOmics, Alemanha) com uma versão atualizada do protocolo. A concentração de proteína foi estimada usando o Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zurique, Suíça). Para cada amostra, 50 µg de proteína foram transferidos para o cartucho e digeridos pela adição de 50 µL da solução 'Digest'. Após 60 minutos de incubação a 37 °C, a digestão foi interrompida com 100 µL de solução Stop. As soluções no cartucho foram removidas por centrifugação a 3800 g, enquanto os peptídeos foram retidos pelo filtro iST. Finalmente, os peptídeos foram lavados, eluídos, secos e ressolubilizados em 20 µL de tampão de injeção (3% de acetonitrila, 0,1% de ácido fórmico).

Análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa

A análise por espectrometria de massa foi realizada em um espectrômetro de massa Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) equipado com uma fonte Digital PicoView (New Objective) e acoplado a um M-Class UPLC (Waters). A composição do solvente nos dois canais foi de 0,1% de ácido fórmico para o canal A e 0,1% de ácido fórmico, 99,9% de acetonitrila para o canal B. Para cada amostra, 2 μL de peptídeos foram carregados em uma coluna comercial MZ Symmetry C18 Trap (100Å, 5 µm , 180 µm x 20 mm, Waters) seguido por nanoEase MZ C18 HSS T3 Column (100Å, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). Os peptídeos foram eluídos a uma taxa de fluxo de 300 nL/min por um gradiente de 8 a 27% B em 85 min, 35% B em 5 min e 80% B em 1 min. As amostras foram adquiridas em ordem aleatória. O espectrômetro de massa foi operado no modo dependente de dados (DDA), adquirindo um espectro MS de varredura completa (350 - 1'400 m/z) com uma resolução de 120'000 a 200 m/z após o acúmulo para um valor alvo de 3'000'000, seguido por fragmentação HCD (dissociação de colisão de alta energia) nos vinte sinais mais intensos por ciclo. Os espectros HCD foram adquiridos com uma resolução de 15'000 usando uma energia de colisão normalizada de 28 e um tempo máximo de injeção de 22 ms. O controle de ganho automático (AGC) foi ajustado para 100.000 íons. A triagem do estado da carga foi habilitada. Estados individuais, não atribuídos e de carga superiores a sete foram rejeitados. Apenas precursores com intensidade acima de 250'000 foram selecionados para MS/MS. As massas precursoras selecionadas anteriormente para medição de MS/MS foram excluídas da seleção posterior por 30 s e a janela de exclusão foi definida em 10 ppm. As amostras foram adquiridas usando calibração de massa de bloqueio interno em m/z 371,1012 e 445,1200.

Identificação e quantificação de proteínas

Os dados MS brutos adquiridos foram processados ​​pelo MaxQuant (versão 1.6.2.3), seguidos pela identificação da proteína usando o mecanismo de busca Andromeda integrado. A análise foi executada no sistema de gerenciamento de informações do laboratório local (LIMS). Os espectros foram pesquisados ​​em um banco de dados contendo o proteoma de referência humana Uniprot (taxonomia 9606, versão canônica de 20180703) e o banco de dados de microbioma oral humano (http://www.homd.org/, versão anotada genomas 460+, 20180702), concatenados ao seu banco de dados fasta isca reversa e contaminantes de proteínas comuns. A carbamidometilação da cisteína foi definida como modificação fixa, enquanto a oxidação da metionina e a acetilação da proteína N-terminal foram definidas como variáveis. A especificidade da enzima foi ajustada para tripsina/P, permitindo um comprimento peptídico mínimo de 7 aminoácidos e um máximo de duas clivagens perdidas. As configurações de pesquisa padrão do MaxQuant Orbitrap foram usadas. A taxa máxima de falsa descoberta (FDR) foi fixada em 0,01 para peptídeos e 0,05 para proteínas. O LFQ foi ativado e uma janela de dois minutos para correspondências entre as execuções foi aplicada. No modelo de projeto experimental MaxQuant, cada arquivo é mantido separado no projeto experimental para obter valores quantitativos individuais.

Intensidades e regulação de proteínas

Um conjunto de funções R implementadas no pacote R prolfqua foi usado para realizar a análise de expressão diferencial. As intensidades de peptídeos relatadas por MaxQuant foram transformadas em log2 e, em seguida, transformadas em z, de modo que as médias e variâncias da amostra fossem iguais. Em seguida, as intensidades proteicas normalizadas foram estimadas a partir das intensidades peptídicas usando o polimento mediano de Tukey. Alterações de log2 vezes na proteína foram computadas com base em intensidades de proteína normalizadas. Um modelo linear com dois fatores (tempo e paciente) foi ajustado para cada proteína, e as diferenças entre os grupos foram estimadas e testadas com base nos parâmetros do modelo. As estimativas de variância foram moderadas usando a abordagem empírica de Bayes, que explora a estrutura paralela do experimento de alto rendimento, o que aumenta o poder estatístico do teste de significância da hipótese nula. Finalmente, os valores de p foram ajustados usando o procedimento de Benjamini e Hochberg para obter os FDRs. Proteínas reguladas diferencialmente entre os pontos de tempo (T1 vs T0, T6 vs T0 e T6 vs T1) foram consideradas em FDR <0,05. A análise de componentes principais foi realizada para fins de visualização usando a função R 'prcomp'.

Análise de caminho

Proteínas humanas reguladas diferencialmente (FDR <0,05) foram ainda submetidas ao aplicativo QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) para investigar quais doenças e processos biológicos foram afetados por mudanças em nosso conjunto de dados de proteoma. A análise é baseada em efeitos causais esperados entre proteínas reguladas e doenças ou funções associadas. O IPA é uma poderosa ferramenta de análise bioinformática, baseada na base de conhecimento da QIAGEN, que combina informações científicas e biomédicas de artigos de periódicos e bancos de dados, que permite a interpretação de uma ampla gama de dados de expressão ômica e previsões de possíveis redes regulatórias e relações causais. Uma análise central foi realizada em 12 de abril de 2022 com base na alteração de log2 vezes e dados de FDR para T1 vs T0 e T6 vs T0, e as principais doenças reguladas e processos biológicos classificados por FDR foram identificados. Além disso, um algoritmo de previsão de escore z foi aplicado e as atividades funcionais ou de doença foram categorizadas como significativamente aumentadas (escores z positivos) ou diminuídas (escores z negativos) para escores z de ≥2 ou ≤-2, respectivamente e apresentados como mapas de calor com diferentes tamanhos quadrados (FDR) e cores (z-scores). Quadrados maiores indicam uma sobreposição mais significativa entre as proteínas reguladas no conjunto de dados e uma doença ou função específica, enquanto as cores dos quadrados refletem a direção da mudança para uma doença ou função (laranja: aumentada, azul: diminuída). As proteínas associadas a uma doença ou função específica foram apresentadas como gráficos de rede indicando a função da proteína, regulação da proteína (regulada para cima ou para baixo) e o tipo previsto de associação/interação (indireta ou direta, ativação ou inibição).

Análise estatística

Um conjunto de funções R implementadas no pacote R prolfqua foi usado para realizar a análise de expressão diferencial. As intensidades de peptídeos relatadas por MaxQuant foram transformadas em log2 e, em seguida, transformadas em z, de modo que as médias e variâncias da amostra fossem iguais. Em seguida, as intensidades proteicas normalizadas foram estimadas a partir das intensidades peptídicas usando o polimento mediano de Tukey. Alterações de log2 vezes na proteína foram computadas com base em intensidades de proteína normalizadas. Um modelo linear com dois fatores (tempo e paciente) foi ajustado para cada proteína, e as diferenças entre os grupos foram estimadas e testadas com base nos parâmetros do modelo. As estimativas de variância foram moderadas usando a abordagem empírica de Bayes, que explora a estrutura paralela do experimento de alto rendimento, o que aumenta o poder estatístico do teste de significância da hipótese nula. Finalmente, os valores de p foram ajustados usando o procedimento de Benjamini e Hochberg para obter os FDRs. Proteínas reguladas diferencialmente entre os pontos de tempo (T1 vs T0, T6 vs T0 e T6 vs T1) foram consideradas em FDR <0,05. A análise de componentes principais foi realizada para fins de visualização usando a função R 'prcomp'.