Proteom śliny w odpowiedzi na niechirurgiczne leczenie periodontologiczne

Badanie populacji i badanie kliniczne

Łącznie 10 zdrowych ogólnoustrojowo i niepalących osób z zapaleniem przyzębia stopnia III stopnia C zostało zrekrutowanych do Oddziału Periodontologii Szkoły Stomatologii Uniwersytetu Aydın Adnan Menderes, Aydın, Turcja.

Ocena stanu przyzębia całej jamy ustnej obejmowała pomiary głębokości zgłębnika, klinicznej utraty przyczepu, odsetka miejsc z krwawieniem podczas sondowania, wskaźnika dziąseł i wskaźnika płytki nazębnej na początku badania (T0) oraz jeden miesiąc (T1) i sześć miesięcy (T6) po leczeniu . Wszystkie pomiary uzyskano z 6 miejsc na ząb, z wyłączeniem trzecich zębów trzonowych, przy użyciu ręcznej sondy periodontologicznej (sonda periodontologiczna William's, Hu-Friedy, Chicago, IL). Resorpcję kości wyrostka zębodołowego oceniano na cyfrowym zdjęciu panoramicznym u każdego uczestnika. Wszystkie pomiary kliniczne zostały wykonane przez doświadczonego periodontologa (licencjat).

Diagnozę zapalenia przyzębia stopnia III stopnia C przeprowadzono zgodnie z kryteriami zaproponowanymi przez International Workshop on the Classification of Periodontal and Peri-implant Diseases 2017.

Leczenie

Konwencjonalne skalowanie kwadrantowe i wygładzanie korzeni (SRP) przeprowadzono na początku badania, po pobraniu śliny i ocenie stanu przyzębia, zaczynając od prawego górnego kwadrantu i kontynuując zgodnie z ruchem wskazówek zegara, podczas czterech wizyt w odstępach tygodniowych. SRP zostało wykonane w znieczuleniu miejscowym przez tego samego periodontologa (BA) przy użyciu instrumentów ultradźwiękowych (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) i ręcznych kiret periodontologicznych (Gracey curets, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Wszystkie obecne zęby były instrumentowane, aż powierzchnia korzenia była optycznie i dotykowo czysta i gładka. Samodzielne kontrolowanie płytki nazębnej obejmowało szczotkowanie zębów zmodyfikowaną techniką Bassa średnią szczoteczką i zwykłą pastą do zębów z fluorem dwa razy dziennie oraz czyszczenie przestrzeni międzyzębowych za pomocą nici dentystycznej i/lub szczoteczek międzyzębowych raz dziennie. Kontrolne pobieranie śliny i oceny periodontologiczne przeprowadzono w T1 i T6 po zakończeniu SRP.

Pobieranie próbek śliny

Niestymulowaną ślinę pełną pobierano od uczestników rano między 8:00 a 10:00 w T0, T1 i T6. Wszyscy pacjenci zostali poproszeni o powstrzymanie się od jedzenia, picia i wszelkich zabiegów higieny jamy ustnej przez 2 godziny przed pobraniem próbki. Pacjentów najpierw poproszono o wypłukanie ust wodą z kranu i odczekanie 5 minut, aby uniknąć rozcieńczenia próbki. Niestymulowaną ślinę zbierano przez okres 5 minut; pacjentów poinstruowano, aby siedzieli z głową pochyloną do przodu, aby zachęcić do biernego ślinienia się i odkrztuszania do sterylnej uniwersalnej rurki z polipropylenu. Po pobraniu próbki natychmiast przeniesiono do lodówki (4°C), podzielono na porcje i zamrożono w temperaturze -80°C do czasu, gdy były potrzebne.

Ilościowa analiza proteomiczna bez etykiet

Próbki supernatantu śliny pobrane w T0, T1 i T6 (n = 30) analizowano przy użyciu ilościowego podejścia proteomicznego bez znaczników (LFQ).

przygotowanie próbki

Próbki przygotowano przy użyciu komercyjnego zestawu iST (PreOmics, Niemcy) ze zaktualizowaną wersją protokołu. Stężenie białka oszacowano za pomocą zestawu Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zurich, Szwajcaria). Dla każdej próbki 50 µg białka przenoszono do kartridża i trawiono przez dodanie 50 µl roztworu „Digest”. Po 60 minutach inkubacji w temperaturze 37°C trawienie zatrzymano 100 µl roztworu Stop. Roztwory we wkładzie usunięto przez odwirowanie przy 3800 g, podczas gdy peptydy zatrzymano na filtrze iST. Na koniec peptydy przemyto, eluowano, wysuszono i ponownie rozpuszczono w 20 ul buforu do iniekcji (3% acetonitryl, 0,1% kwas mrówkowy).

Analiza metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas

Analizę spektrometrii masowej przeprowadzono na spektrometrze masowym Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) wyposażonym w źródło Digital PicoView (New Objective) i sprzężonym z M-Class UPLC (Waters). Skład rozpuszczalnika w dwóch kanałach wynosił 0,1% kwasu mrówkowego dla kanału A i 0,1% kwasu mrówkowego, 99,9% acetonitrylu dla kanału B. Dla każdej próbki 2 μl peptydów załadowano na komercyjną kolumnę MZ Symmetry C18 Trap Column (100Å, 5 μm , 180 µm x 20 mm, Waters), a następnie kolumna nanoEase MZ C18 HSS T3 (100 A, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). Peptydy eluowano przy szybkości przepływu 300 nl/min w gradiencie od 8 do 27% B w 85 min, 35% B w 5 min i 80% B w 1 min. Próbki pobierano w losowej kolejności. Spektrometr masowy pracował w trybie zależnym od danych (DDA), uzyskując pełnoskanowe widma MS (350 - 1'400 m/z) w rozdzielczości 120'000 przy 200 m/z po akumulacji do docelowej wartości 3 000 000, a następnie fragmentacja HCD (dysocjacja zderzeń o wyższych energiach) na dwudziestu najbardziej intensywnych sygnałach na cykl. Widma HCD uzyskano z rozdzielczością 15 000 stosując znormalizowaną energię zderzenia 28 i maksymalny czas wstrzykiwania 22 ms. Automatyczna kontrola wzmocnienia (AGC) została ustawiona na 100'000 jonów. Kontrola stanu naładowania została włączona. Pojedyncze, nieprzypisane i stany naładowania wyższe niż siedem zostały odrzucone. Do MS/MS wybrano tylko prekursory o intensywności powyżej 250 000. Masy prekursorów wybrane wcześniej do pomiaru MS/MS wykluczono z dalszej selekcji na 30 s, a okno wykluczenia ustawiono na 10 ppm. Próbki pobrano za pomocą wewnętrznej kalibracji masy blokady na m/z 371.1012 i 445.1200.

Identyfikacja i ocena ilościowa białek

Uzyskane surowe dane MS zostały przetworzone przez MaxQuant (wersja 1.6.2.3), a następnie dokonano identyfikacji białek za pomocą zintegrowanej wyszukiwarki Andromeda. Analiza została przeprowadzona na lokalnym systemie zarządzania informacjami laboratoryjnymi (LIMS). Widma przeszukano w bazie danych zawierającej ludzki proteom referencyjny Uniprot (taksonomia 9606, wersja kanoniczna z 20180703) i ludzką bazę danych mikrobiomu ustnego (http://www.homd.org/, wersja z adnotacjami genomów 460+, 20180702), połączona z ich odwróconą bazą danych fasta wabika i typowymi zanieczyszczeniami białkowymi. Karbamidometylacja cysteiny została ustawiona jako stała modyfikacja, podczas gdy utlenianie metioniny i acetylacja N-końcowego białka zostały ustawione jako zmienne. Specyficzność enzymu ustawiono na trypsynę/P, pozwalając na minimalną długość peptydu wynoszącą 7 aminokwasów i maksymalnie dwa pominięte cięcia. Użyto domyślnych ustawień wyszukiwania MaxQuant Orbitrap. Maksymalny współczynnik fałszywych odkryć (FDR) ustalono na 0,01 dla peptydów i 0,05 dla białek. Włączono LFQ i zastosowano dwuminutowe okno dla dopasowań między przebiegami. W szablonie projektu eksperymentalnego MaxQuant każdy plik jest przechowywany osobno w projekcie eksperymentalnym, aby uzyskać indywidualne wartości ilościowe.

Intensywność i regulacja białek

Do wykonania analizy wyrażeń różniczkowych wykorzystano zestaw funkcji R zaimplementowanych w pakiecie R prolfqua. Intensywności peptydów zgłoszone przez MaxQuant zostały przekształcone log2, a następnie przekształcone z, tak że średnie próbki i wariancje były równe. Następnie na podstawie intensywności peptydów oszacowano znormalizowane intensywności białek, stosując medianę polerowania Tukeya. Białko log2-krotne zmiany obliczono na podstawie znormalizowanych intensywności białek. Do każdego białka dopasowano model liniowy z dwoma czynnikami (czas i pacjent), a różnice między grupami oszacowano i przetestowano na podstawie parametrów modelu. Szacunki wariancji były moderowane przy użyciu empirycznego podejścia Bayesa, które wykorzystuje równoległą strukturę eksperymentu o dużej przepustowości, co zwiększa moc statystyczną testu istotności hipotezy zerowej. Na koniec wartości p zostały dostosowane przy użyciu procedury Benjaminiego i Hochberga w celu uzyskania FDR. Białka regulowane w różny sposób pomiędzy punktami czasowymi (T1 vs T0, T6 vs T0 i T6 vs T1) były rozważane przy FDR <0,05. Analizę składowych głównych przeprowadzono dla celów wizualizacji przy użyciu funkcji R „prcomp”.

Analiza ścieżki

Białka ludzkie o zróżnicowanej regulacji (FDR <0,05) poddano następnie aplikacji QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) w celu zbadania, na które choroby i procesy biologiczne miały wpływ regulacje zmiany w naszym zbiorze danych proteomu. Analiza opiera się na oczekiwanych skutkach przyczynowych między regulowanymi białkami a powiązanymi chorobami lub funkcjami. IPA to potężne narzędzie do analizy bioinformatycznej, oparte na bazie wiedzy firmy QIAGEN, łączącej informacje naukowe i biomedyczne z artykułów z czasopism i baz danych, które umożliwia interpretację szerokiego zakresu danych dotyczących ekspresji omicznej oraz przewidywanie potencjalnych sieci regulacyjnych i związków przyczynowych. Podstawową analizę przeprowadzono 12 kwietnia 2022 r. w oparciu o log2-krotną zmianę i dane FDR dla T1 vs T0 i T6 vs T0, i zidentyfikowano najlepiej regulowane choroby i procesy biologiczne uszeregowane według FDR. Ponadto zastosowano algorytm przewidywania z-score, a choroby lub czynności funkcjonalne zostały sklasyfikowane jako znacząco zwiększone (dodatnie z-score) lub zmniejszone (ujemne z-score) odpowiednio dla z-score ≥2 lub ≤-2 i przedstawione jako mapy popularności z różnymi rozmiarami kwadratów (FDR) i kolorami (z-scores). Większe kwadraty wskazują na bardziej znaczące nakładanie się regulowanych białek w zbiorze danych i określonej choroby lub funkcji, podczas gdy kwadratowe kolory odzwierciedlają kierunek zmian dla choroby lub funkcji (pomarańczowy: wzrost, niebieski: spadek). Białka związane z określoną chorobą lub funkcją zostały przedstawione jako wykresy sieciowe wskazujące funkcję białka, regulację białka (regulacja w górę lub w dół) oraz przewidywany typ asocjacji/interakcji (pośredni lub bezpośredni, aktywacja lub hamowanie).

Analiza statystyczna

Do wykonania analizy wyrażeń różniczkowych wykorzystano zestaw funkcji R zaimplementowanych w pakiecie R prolfqua. Intensywności peptydów zgłoszone przez MaxQuant zostały przekształcone log2, a następnie przekształcone z, tak że średnie próbki i wariancje były równe. Następnie na podstawie intensywności peptydów oszacowano znormalizowane intensywności białek, stosując medianę polerowania Tukeya. Białko log2-krotne zmiany obliczono na podstawie znormalizowanych intensywności białek. Do każdego białka dopasowano model liniowy z dwoma czynnikami (czas i pacjent), a różnice między grupami oszacowano i przetestowano na podstawie parametrów modelu. Szacunki wariancji były moderowane przy użyciu empirycznego podejścia Bayesa, które wykorzystuje równoległą strukturę eksperymentu o dużej przepustowości, co zwiększa moc statystyczną testu istotności hipotezy zerowej. Na koniec wartości p zostały dostosowane przy użyciu procedury Benjaminiego i Hochberga w celu uzyskania FDR. Białka regulowane w różny sposób pomiędzy punktami czasowymi (T1 vs T0, T6 vs T0 i T6 vs T1) były rozważane przy FDR <0,05. Analizę składowych głównych przeprowadzono dla celów wizualizacji przy użyciu funkcji R „prcomp”.