Sylkiproteomi vasteena ei-kirurgiseen parodontaalihoitoon

Tutkimuspopulaatio ja kliininen tutkimus

Yhteensä 10 systeemisesti tervettä ja tupakoimatonta henkilöä, joilla oli vaiheen III, asteen C parodontiitti, rekrytoitiin Aydın Adnan Menderes -yliopiston hammaslääketieteen laitokselle, Aydın, Turkki.

Täyssuun periodontaaliseen arviointiin sisältyi koetussyvyyden mittaukset, kliinisen kiinnittymisen menetys, verenvuotokohtien prosenttiosuus koetuksella, ienindeksi ja plakkiindeksi lähtötasolla (T0) sekä kuukauden (T1) ja kuuden kuukauden (T6) hoidon jälkeen. . Kaikki mittaukset saatiin 6 kohdasta hammasta kohden lukuun ottamatta kolmatta poskihampaa käyttämällä manuaalista parodontaalikoetinta (William's periodontal probe, Hu-Friedy, Chicago, IL). Alveolaarisen luun resorptio arvioitiin digitaalisella panoraamaröntgenkuvalla jokaisessa osallistujassa. Kaikki kliiniset mittaukset suoritti kokenut parodontologi (B.A.).

Vaiheen III, asteen C parodontiitin diagnoosi tehtiin vuoden 2017 International Workshop on the Classification of Periodontal and Peri-implant Diseases and Conditions ehdottamien kriteerien mukaan.

Hoito

Perinteinen kvadranttikohtainen skaalaus ja juuren höyläys (SRP) suoritettiin lähtötilanteessa syljenkeräyksen ja parodontaalisen arvioinnin jälkeen alkaen oikeasta yläneljänneksestä ja jatkaen myötäpäivään neljän käynnin aikana viikoittain. Sama parodontologi (BA) suoritti SRP:n paikallispuudutuksessa käyttämällä ultraäänilaitteita (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) ja manuaalisia parodontaalikyreettejä (Gracey curets, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Kaikki nykyiset hampaat instrumentoitiin, kunnes juuripinta oli visuaalisesti ja tuntopuhtaasti puhdas ja sileä. Itse suoritetut plakintorjuntatoimenpiteet koostuivat hampaiden harjauksesta modifioidulla Bass-tekniikalla keskikokoisella hammasharjalla ja tavallisella fluoria sisältävällä hammastahnalla kahdesti päivässä sekä hammasvälien puhdistuksesta hammaslangalla ja/tai hammasväliharjoilla kerran päivässä. Seurantasylkinäytteenotto ja periodontaaliset arvioinnit suoritettiin T1- ja T6-aikoina SRP:n päätyttyä.

Sylkinäytteenotto

Stimuloimaton koko sylki saatiin osallistujilta aamulla klo 8.00 - 10.00 välillä T0, T1 ja T6. Kaikkia potilaita pyydettiin pidättymään syömisestä, juomisesta ja kaikista suuhygieniatoimenpiteistä 2 tunnin ajan ennen näytteenottoa. Potilaita pyydettiin ensin huuhtelemaan suunsa vesijohtovedellä ja odottamaan 5 minuuttia näytteen laimentumisen välttämiseksi. Stimuloimatonta sylkeä kerättiin 5 minuutin aikana; potilaita kehotettiin istumaan pää kallistettuna eteenpäin passiivisen kuolaamisen edistämiseksi, ja yskä yskättiin steriiliin yleiseen polypropyleenisäiliöputkeen. Näytteenoton jälkeen näytteet siirrettiin välittömästi kylmävarastoon (4 °C), jaettiin eriin ja pakastettiin -80 °C:seen, kunnes niitä tarvittiin.

Merkitön kvantitatiivinen proteominen analyysi

T0:ssa, T1:ssä ja T6:ssa (n = 30) kerätyt syljen supernatanttinäytteet analysoitiin käyttämällä leimatonta kvantitatiivista (LFQ) proteomista lähestymistapaa.

näytteen valmistus

Näytteet valmistettiin käyttämällä kaupallista iST-sarjaa (PreOmics, Saksa) protokollan päivitetyllä versiolla. Proteiinipitoisuus arvioitiin käyttämällä Qubit® Protein Assay Kit -sarjaa (Life Technologies, Zürich, Sveitsi). Jokaista näytettä kohti 50 ug proteiinia siirrettiin patruunaan ja pilkottiin lisäämällä 50 ui "Digest"-liuosta. 60 minuutin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa digestio pysäytettiin 100 ul:lla Stop-liuosta. Patruunassa olevat liuokset poistettiin sentrifugoimalla 3800 g:llä, kun taas peptidit säilytettiin iST-suodattimessa. Lopuksi peptidit pestiin, eluoitiin, kuivattiin ja liuotettiin uudelleen 20 ul:aan injektiopuskuria (3 % asetonitriiliä, 0,1 % muurahaishappoa).

Nestekromatografia-massaspektrometria-analyysi

Massaspektrometria-analyysi suoritettiin Q Exactive HF-X -massaspektrometrillä (Thermo Scientific), joka oli varustettu Digital PicoView -lähteellä (New Objective) ja kytketty M-luokan UPLC:hen (Waters). Liuotinkoostumus molemmissa kanavissa oli 0,1 % muurahaishappoa kanavalle A ja 0,1 % muurahaishappoa, 99,9 % asetonitriiliä kanavalle B. Kutakin näytettä kohti ladattiin 2 µl peptidejä kaupalliseen MZ Symmetry C18 Trap Column -pylvääseen (100 A, 5 µm). , 180 um x 20 mm, Waters), jota seuraa nanoEase MZ C18 HSS T3 -kolonni (100 A, 1,8 um, 75 um x 250 mm, Waters). Peptidit eluoitiin virtausnopeudella 300 nl/min gradientilla 8 - 27 % B 85 minuutissa, 35 % B 5 minuutissa ja 80 % B 1 minuutissa. Näytteet otettiin satunnaisessa järjestyksessä. Massaspektrometriä käytettiin data-riippuvaisessa tilassa (DDA) ja saatiin täyden skannauksen MS-spektrit (350 - 1'400 m/z) resoluutiolla 120 000 taajuudella 200 m/z tavoitearvoon kertymisen jälkeen. 3'000'000, jota seuraa HCD- (korkeanenerginen törmäysdissosiaatio) -fragmentointi kahdellakymmenellä voimakkaimmalla signaalilla sykliä kohti. HCD-spektrit hankittiin 15 000:n resoluutiolla käyttämällä normalisoitua törmäysenergiaa 28 ja maksimiinjektioaikaa 22 ms. Automaattinen vahvistuksen säätö (AGC) asetettiin 100 000 ioniin. Lataustilan tarkistus otettiin käyttöön. Yksittäiset, määrittämättömät ja yli seitsemän lataustilat hylättiin. Vain esiasteet, joiden intensiteetti oli yli 250 000, valittiin MS/MS:lle. Aiemmin MS/MS-mittaukseen valitut prekursorimassat suljettiin pois lisävalinnasta 30 sekunnin ajaksi, ja poissulkemisikkuna asetettiin arvoon 10 ppm. Näytteet hankittiin käyttämällä sisäistä lukkomassakalibrointia m/z-arvoilla 371,1012 ja 445,1200.

Proteiinin tunnistaminen ja kvantifiointi

Hankitut raaka-MS-tiedot käsiteltiin MaxQuantilla (versio 1.6.2.3), minkä jälkeen proteiinitunnistettiin integroidulla Andromeda-hakukoneella. Analyysi suoritettiin paikallisella laboratorion tiedonhallintajärjestelmällä (LIMS). Spektriä haettiin tietokannasta, joka sisälsi Uniprotin ihmisen referenssiproteomin (taksonomia 9606, kanoninen versio vuodesta 20180703) ja Human oral Microbiome Database -tietokannasta (http://www.homd.org/, versio annotoidut genomit 460+, 20180702), ketjutettu niiden käänteiseen houkuteltuun fasta-tietokantaan ja yleisiin proteiinikontaminantteihin. Kysteiinin karbamidomeylaatio asetettiin kiinteäksi modifikaatioksi, kun taas metioniinin hapetus ja N-terminaalinen proteiiniasetylaatio asetettiin muuttuviksi. Entsyymi-spesifisyys asetettiin trypsiini/P:ksi, mikä mahdollisti 7 aminohapon peptidin minimipituuden ja enintään kaksi puuttuvaa katkaisua. Käytettiin MaxQuant Orbitrapin oletushakuasetuksia. Suurin väärien löydösten määrä (FDR) asetettiin arvoon 0,01 peptideille ja 0,05 proteiineille. LFQ otettiin käyttöön ja otettiin käyttöön kahden minuutin ikkuna ajojen välisille otteluille. MaxQuant-kokeellisessa suunnittelumallissa jokainen tiedosto pidetään erillään kokeellisessa suunnittelussa yksittäisten kvantitatiivisten arvojen saamiseksi.

Proteiinin intensiteetit ja säätely

R-toimintojen joukkoa, joka oli toteutettu R-paketissa prolfqua, käytettiin differentiaaliekspressio-analyysin suorittamiseen. MaxQuantin ilmoittamat peptidi-intensiteetit log2-muunnettiin ja sitten z-transformoitiin niin, että näytekeskiarvot ja varianssit olivat yhtä suuret. Seuraavaksi normalisoidut proteiini-intensiteetit arvioitiin peptidin intensiteetistä käyttämällä Tukeyn mediaanikiillotusta. Proteiinin log2-kertaiset muutokset laskettiin normalisoitujen proteiini-intensiteettien perusteella. Jokaiselle proteiinille sovitettiin lineaarinen malli kahdella tekijällä (aika ja potilas), ja ryhmäerot arvioitiin ja testattiin mallin parametrien perusteella. Varianssiarvioita moderoitiin käyttämällä empiiristä Bayes-lähestymistapaa, jossa hyödynnetään korkean suorituskyvyn kokeen rinnakkaisrakennetta, mikä lisää nollahypoteesin merkitsevyystestin tilastollista tehoa. Lopuksi p-arvot säädettiin käyttämällä Benjamini- ja Hochberg-menettelyä FDR:ien saamiseksi. Differentiaalisesti säädellyt proteiinit aikapisteiden välillä (T1 vs T0, T6 vs T0 ja T6 vs T1) otettiin huomioon FDR:ssä <0,05. Pääkomponenttianalyysi suoritettiin visualisointitarkoituksiin käyttämällä R-funktiota 'prcomp'.

Reittianalyysi

Erilaisesti säädellyt ihmisen proteiinit (FDR <0,05) altistettiin edelleen QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) -sovellukselle (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) sen tutkimiseksi, mihin sairauksiin ja biologisiin prosesseihin säätely vaikutti. muutoksia proteomitietoaineistossamme. Analyysi perustuu odotettuihin syy-vaikutuksiin säädeltyjen proteiinien ja niihin liittyvien sairauksien tai toimintojen välillä. IPA on tehokas bioinformaattinen analyysityökalu, joka perustuu QIAGENin Knowledge Base -tietokantaan, jossa yhdistyvät tieteelliset ja biolääketieteelliset tiedot aikakauslehtiartikkeleista ja tietokannoista. Se mahdollistaa monenlaisten omikkien ilmaisutietojen tulkinnan ja mahdollisten säätelyverkostojen ja syy-suhteiden ennustamisen. Ydinanalyysi suoritettiin 12. huhtikuuta 2022 log2-kertaisten muutosten ja FDR-tietojen perusteella T1 vs. T0 ja T6 vs T0, ja FDR:n mukaan luokiteltiin parhaiten säädellyt sairaudet ja biologiset prosessit. Lisäksi käytettiin z-pisteiden ennustusalgoritmia ja sairaudet tai toiminnalliset aktiviteetit luokiteltiin merkittävästi lisääntyneiksi (positiiviset z-pisteet) tai vähentyneeksi (negatiiviset z-pisteet) z-pisteille, jotka olivat ≥2 tai ≤-2, ja esitettiin seuraavasti: lämpökartat, joissa on eri neliökokoja (FDR) ja värejä (z-pisteet). Suuremmat neliöt osoittavat merkittävämpää päällekkäisyyttä tietojoukon säänneltyjen proteiinien ja tietyn sairauden tai toiminnon välillä, kun taas neliön värit heijastavat sairauden tai toiminnon muutoksen suuntaa (oranssi: lisääntynyt, sininen: vähentynyt). Tiettyyn sairauteen tai toimintoon liittyvät proteiinit esitettiin verkkokaavioina, jotka osoittavat proteiinin toiminnan, proteiinin säätelyn (ylös- tai alaspäin säädelty) ja ennustetun assosiaatio-/vuorovaikutustyypin (epäsuora tai suora, aktivaatio tai esto).

Tilastollinen analyysi

R-toimintojen joukkoa, joka oli toteutettu R-paketissa prolfqua, käytettiin differentiaaliekspressio-analyysin suorittamiseen. MaxQuantin ilmoittamat peptidi-intensiteetit log2-muunnettiin ja sitten z-transformoitiin niin, että näytekeskiarvot ja varianssit olivat yhtä suuret. Seuraavaksi normalisoidut proteiini-intensiteetit arvioitiin peptidin intensiteetistä käyttämällä Tukeyn mediaanikiillotusta. Proteiinin log2-kertaiset muutokset laskettiin normalisoitujen proteiini-intensiteettien perusteella. Jokaiselle proteiinille sovitettiin lineaarinen malli kahdella tekijällä (aika ja potilas), ja ryhmäerot arvioitiin ja testattiin mallin parametrien perusteella. Varianssiarvioita moderoitiin käyttämällä empiiristä Bayes-lähestymistapaa, jossa hyödynnetään korkean suorituskyvyn kokeen rinnakkaisrakennetta, mikä lisää nollahypoteesin merkitsevyystestin tilastollista tehoa. Lopuksi p-arvot säädettiin käyttämällä Benjamini- ja Hochberg-menettelyä FDR:ien saamiseksi. Differentiaalisesti säädellyt proteiinit aikapisteiden välillä (T1 vs T0, T6 vs T0 ja T6 vs T1) otettiin huomioon FDR:ssä <0,05. Pääkomponenttianalyysi suoritettiin visualisointitarkoituksiin käyttämällä R-funktiota 'prcomp'.