Salivproteom som svar på icke-kirurgisk periodontal behandling

Studiepopulation och klinisk undersökning

Totalt 10 systemiskt friska och icke-rökare individer med periodontit i stadium III, grad C rekryterades vid Institutionen för parodontologi, School of Dentistry, Aydın Adnan Menderes University, Aydın, Turkiet.

Parodontal bedömning i hela munnen inkluderade mätningar av sonderingsdjup, klinisk fästförlust, procentandelen av platser med blödning vid sondering, gingivalindex och plackindex vid baslinjen (T0) och en månad (T1) och sex månader (T6) efter behandling . Alla mätningar erhölls från 6 ställen per tand exklusive tredje molarer med användning av en manuell periodontal sond (William's periodontal sond, Hu-Friedy, Chicago, IL). Den alveolära benresorptionen utvärderades på den digitala panoramaröntgenbilden hos varje deltagare. Alla kliniska mätningar utfördes av en erfaren parodontolog (B.A.).

Diagnos av periodontit i stadium III, grad C utfördes enligt de kriterier som föreslagits av 2017 års internationella workshop om klassificering av periodontala och periimplantatsjukdomar och tillstånd.

Behandling

Konventionell kvadrantvis skalning och rotplaning (SRP) utfördes vid baslinjen, efter salivinsamling och periodontal bedömning, med början med den övre högra kvadranten och fortsatte medurs över fyra besök med veckovisa intervall. SRP utfördes under lokalbedövning av samma parodontolog (B.A.) med användning av ultraljudsinstrument (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) och manuella parodontala kyretter (Gracey-kuretter, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Alla närvarande tänder instrumenterades tills rotytan var visuellt och taktil ren och slät. Självutförda plackkontrollåtgärder bestod av tandborstning med den modifierade Bass-tekniken med en medelstor tandborste och en vanlig tandkräm med fluor två gånger om dagen och interdental rengöring med tandtråd och/eller interdentalborstar en gång om dagen. Uppföljande salivprovtagning och parodontala bedömningar utfördes vid T1 och T6 efter avslutad SRP.

Salivprovtagning

Ostimulerad hel saliv erhölls från deltagarna på morgonen mellan 8:00 - 10:00 vid T0, T1 och T6. Alla patienter ombads att avstå från att äta, dricka och alla munhygienprocedurer i 2 timmar före provtagning. Patienterna ombads först att skölja munnen med kranvatten och vänta i 5 minuter för att undvika provspädning. Ostimulerad saliv samlades upp under en 5-minutersperiod; patienterna instruerades att sitta med huvudet lutat framåt för att uppmuntra passiv dregling, upphostning till ett sterilt universellt polypropenrör. Efter provtagning överfördes proverna omedelbart till kylförvaring (4 °C), alikvoterades och frystes vid -80 °C tills de behövdes.

Etikettfri kvantitativ proteomisk analys

Salivsupernatantprover insamlade vid T0, T1 och T6 (n = 30) analyserades med användning av en märkningsfri kvantitativ (LFQ) proteomisk metod.

Provberedning

Prover bereddes med hjälp av ett kommersiellt iST Kit (PreOmics, Tyskland) med en uppdaterad version av protokollet. Proteinkoncentrationen uppskattades med hjälp av Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zürich, Schweiz). För varje prov överfördes 50 µg protein till patronen och spjälkades genom att tillsätta 50 µL av "Digest"-lösningen. Efter 60 minuters inkubation vid 37 °C stoppades nedbrytningen med 100 µL Stop-lösning. Lösningarna i patronen avlägsnades genom centrifugering vid 3800 g, medan peptiderna hölls kvar av iST-filtret. Slutligen tvättades peptiderna, eluerades, torkades och återsolubiliserades i 20 µL injektionsbuffert (3 % acetonitril, 0,1 % myrsyra).

Vätskekromatografi-masspektrometrianalys

Masspektrometrianalys utfördes på en Q Exactive HF-X masspektrometer (Thermo Scientific) utrustad med en Digital PicoView-källa (New Objective) och kopplad till en M-klass UPLC (Waters). Lösningsmedelssammansättningen vid de två kanalerna var 0,1 % myrsyra för kanal A och 0,1 % myrsyra, 99,9 % acetonitril för kanal B. För varje prov laddades 2 μL peptider på en kommersiell MZ Symmetry C18 Trap Column (100Å, 5 µm) , 180 µm x 20 mm, Waters) följt av nanoEase MZ C18 HSS T3 Column (100Å, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). Peptiderna eluerades med en flödeshastighet av 300 nL/min med en gradient från 8 till 27 % B på 85 min, 35 % B på 5 min och 80 % B på 1 min. Prover togs i en randomiserad ordning. Masspektrometern kördes i databeroende läge (DDA) och fick ett fullskannings-MS-spektra (350 - 1'400 m/z) med en upplösning på 120'000 vid 200 m/z efter ackumulering till ett målvärde på 3'000'000, följt av HCD-fragmentering (higher-energy collision dissociation) på de tjugo mest intensiva signalerna per cykel. HCD-spektra förvärvades med en upplösning på 15 000 med en normaliserad kollisionsenergi på 28 och en maximal injektionstid på 22 ms. Den automatiska förstärkningskontrollen (AGC) var inställd på 100 000 joner. Kontroll av laddningstillstånd har aktiverats. Enkelt, otilldelat och laddningstillstånd högre än sju avvisades. Endast prekursorer med intensitet över 250 000 valdes ut för MS/MS. Prekursormassor som tidigare valts för MS/MS-mätning uteslöts från ytterligare urval under 30 s, och uteslutningsfönstret sattes till 10 ppm. Proverna erhölls med hjälp av intern låsmassakalibrering på m/z 371.1012 och 445.1200.

Proteinidentifiering och kvantifiering

Den inhämtade råa MS-datan bearbetades av MaxQuant (version 1.6.2.3), följt av proteinidentifiering med den integrerade Andromeda-sökmotorn. Analysen kördes på det lokala laboratorieinformationshanteringssystemet (LIMS). Spektra söktes mot en databas innehållande det mänskliga referensproteomet Uniprot (taxonomi 9606, kanonisk version från 20180703) och Human oral Microbiome Database (http://www.homd.org/, versionskommentarerade genom 460+, 20180702), sammanlänkade till deras omvända lockade fasta-databas och vanliga proteinföroreningar. Karbamidometylering av cystein sattes som fast modifiering, medan metioninoxidation och N-terminal proteinacetylering sattes som variabla. Enzymspecificiteten sattes till trypsin/P, vilket medgav en minimal peptidlängd på 7 aminosyror och maximalt två missade klyvningar. MaxQuant Orbitraps standardsökinställningar användes. Den maximala falska upptäcktshastigheten (FDR) sattes till 0,01 för peptider och 0,05 för proteiner. LFQ aktiverades och ett tvåminutersfönster för matcher mellan körningarna tillämpades. I den experimentella designmallen MaxQuant hålls varje fil separat i den experimentella designen för att få individuella kvantitativa värden.

Proteinintensitet och reglering

En uppsättning R-funktioner implementerade i R-paketet prolfqua användes för att utföra differentialexpressionsanalysen. Peptidintensiteterna rapporterade av MaxQuant log2-transformerades och z-transformerades sedan så att provmedelvärdena och varianserna var lika. Därefter uppskattades normaliserade proteinintensiteter från peptidintensiteterna med användning av Tukeys medianpolering. Protein log2-faldiga förändringar beräknades baserat på normaliserade proteinintensiteter. En linjär modell med två faktorer (tid och patient) anpassades till varje protein, och gruppskillnader uppskattades och testades baserat på modellparametrarna. Variansuppskattningarna modererades med den empiriska Bayes-metoden, som utnyttjar den parallella strukturen hos experimentet med hög genomströmning, vilket ökar den statistiska styrkan hos nollhypotesens signifikanstest. Slutligen justerades p-värdena med användning av Benjamini och Hochberg-proceduren för att erhålla FDR. Differentiellt reglerade proteiner mellan tidpunkterna (T1 vs T0, T6 vs T0 och T6 vs T1) ansågs vid FDR <0,05. Huvudkomponentanalys utfördes i visualiseringssyfte med R-funktionen 'prcomp'.

Väganalys

Differentiellt reglerade humana proteiner (FDR <0,05) underkastades ytterligare QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ansökan (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) för att undersöka vilka sjukdomar och biologiska processer som påverkades av reglering förändringar i vår proteomdatauppsättning. Analysen baseras på förväntade orsakseffekter mellan reglerade proteiner och associerade sjukdomar eller funktioner. IPA är ett kraftfullt bioinformatiskt analysverktyg, baserat på QIAGENs kunskapsbas som kombinerar vetenskaplig och biomedicinsk information från tidskriftsartiklar och databaser, som möjliggör tolkning av ett brett utbud av omics-uttrycksdata och förutsägelser om potentiella regulatoriska nätverk och orsakssamband. En kärnanalys utfördes den 12 april 2022 baserat på log2-faldig förändring och FDR-data för T1 vs T0 och T6 vs T0, och de toppreglerade sjukdomarna och biologiska processerna rankade efter FDR identifierades. Dessutom användes en z-poäng förutsägelsealgoritm och sjukdom eller funktionella aktiviteter kategoriserades som signifikant ökade (positiva z-poäng) eller minskade (negativa z-poäng) för z-poäng på ≥2 respektive ≤-2 och presenterades som värmekartor med olika kvadratstorlekar (FDR) och färger (z-poäng). Större rutor indikerar en mer signifikant överlappning mellan de reglerade proteinerna i datasetet och en specifik sjukdom eller funktion, medan fyrkantiga färger återspeglar förändringsriktningen för en sjukdom eller funktion (orange: ökad, blå: minskad). Proteiner associerade med en specifik sjukdom eller funktion presenterades som nätverksdiagram som indikerar proteinfunktion, proteinreglering (upp- eller nedreglerad) och den förutsagda typen av association/interaktion (indirekt eller direkt, aktivering eller hämning).

Statistisk analys

En uppsättning R-funktioner implementerade i R-paketet prolfqua användes för att utföra differentialexpressionsanalysen. Peptidintensiteterna rapporterade av MaxQuant log2-transformerades och z-transformerades sedan så att provmedelvärdena och varianserna var lika. Därefter uppskattades normaliserade proteinintensiteter från peptidintensiteterna med användning av Tukeys medianpolering. Protein log2-faldiga förändringar beräknades baserat på normaliserade proteinintensiteter. En linjär modell med två faktorer (tid och patient) anpassades till varje protein, och gruppskillnader uppskattades och testades baserat på modellparametrarna. Variansuppskattningarna modererades med den empiriska Bayes-metoden, som utnyttjar den parallella strukturen hos experimentet med hög genomströmning, vilket ökar den statistiska styrkan hos nollhypotesens signifikanstest. Slutligen justerades p-värdena med användning av Benjamini och Hochberg-proceduren för att erhålla FDR. Differentiellt reglerade proteiner mellan tidpunkterna (T1 vs T0, T6 vs T0 och T6 vs T1) ansågs vid FDR <0,05. Huvudkomponentanalys utfördes i visualiseringssyfte med R-funktionen 'prcomp'.