唾液蛋白质组对非手术牙周治疗的反应

研究人群和临床检查

土耳其艾登阿德南曼德雷斯大学牙科学院牙周病学系招募了 10 名患有 III 期 C 级牙周炎的全身健康且非吸烟者。

全口牙周评估包括基线（T0）以及治疗后一个月（T1）和六个月（T6）时探诊深度、临床附着丧失、探诊出血部位百分比、牙龈指数和菌斑指数的测量。 所有测量均使用手动牙周探针（William's牙周探针，Hu-Friedy，芝加哥，伊利诺伊州）从每颗牙齿的 6 个部位（第三磨牙除外）获得。 通过数字全景X光片评估每位参与者的牙槽骨吸收情况。 所有临床测量均由经验丰富的牙周病医生 (B.A.) 进行。

根据2017年牙周和种植体周围疾病和病症分类国际研讨会提出的标准进行III期C级牙周炎的诊断。

治疗

在唾液收集和牙周评估之后，在基线时进行传统的象限洁牙和根面平整（SRP），从右上象限开始，并以每周一次的间隔按顺时针方向继续进行四次就诊。 SRP 由同一位牙周病医生 (B.A.) 在局部麻醉下使用超声波仪器（Mini Piezon，EMS，Nyon，CH）和手动牙周刮匙（Gracey curets，洁牙器 Hu-Friedy，芝加哥，IL）进行。 对所有现有牙齿进行仪器检测，直到牙根表面在视觉上和触觉上都清洁且光滑。 自行执行的牙菌斑控制措施包括使用改进的巴斯技术、中型牙刷和普通含氟牙膏每天两次刷牙，以及每天一次使用牙线和/或牙间刷清洁牙间。 完成 SRP 后，在 T1 和 T6 时进行后续唾液采样和牙周评估。

唾液采样

在上午 8:00 至 10:00 之间（T0、T1 和 T6）从参与者处获取未刺激的全唾液。 要求所有患者在采样前 2 小时内禁食、禁水和进行所有口腔卫生程序。 首先要求患者用自来水漱口并等待 5 分钟，以避免样本稀释。 5 分钟内收集未受刺激的唾液；患者被要求坐着，头部向前倾斜，以鼓励被动流口水，将痰吐入无菌通用聚丙烯容器管中。 取样后，样品立即转移至冷藏（4℃），等分并冷冻在-80℃下直至需要。

无标记定量蛋白质组分析

使用无标记定量 (LFQ) 蛋白质组方法对 T0、T1 和 T6 (n = 30) 收集的唾液上清液样本进行分析。

样品制备

使用商业 iST 试剂盒（PreOmics，德国）和更新版本的方案制备样品。 使用 Qubit® 蛋白质测定试剂盒（Life Technologies，苏黎世，瑞士）估算蛋白质浓度。 对于每个样品，将 50 µg 蛋白质转移到柱中，并通过添加 50 µL“消化”溶液进行消化。 37°C 孵育 60 分钟后，用 100 µL 终止溶液终止消化。 通过 3800 g 离心去除柱中的溶液，而肽则通过 iST 过滤器保留。 最后，将肽洗涤、洗脱、干燥并重新溶解在 20 µL 注射缓冲液（3% 乙腈、0.1% 甲酸）中。

液相色谱-质谱分析

质谱分析在配备 Digital PicoView 源（新物镜）并与 M-Class UPLC（Waters）耦合的 Q Exactive HF-X 质谱仪（Thermo Scientific）上进行。 两个通道的溶剂成分为：通道 A 为 0.1% 甲酸，通道 B 为 0.1% 甲酸、99.9% 乙腈。对于每个样品，将 2 μL 肽加载到商用 MZ Symmetry C18 Trap Column（100Å，5 µm）上。 ，180 µm x 20 mm，Waters），然后使用 nanoEase MZ C18 HSS T3 色谱柱（100Å，1.8 µm，75 µm x 250 mm，Waters）。 以 300 nL/min 的流速通过 85 分钟内 8% B 到 27% B、5 分钟内 35% B 和 1 分钟内 80% B 的梯度洗脱肽。 样品按随机顺序采集。 质谱仪在数据依赖模式 (DDA) 下运行，在累积到目标值后，以 120'000、200 m/z 的分辨率获取全扫描 MS 谱图 (350 - 1,400 m/z) 3'000'000，然后是每个周期 20 个最强烈的信号上的 HCD（高能碰撞解离）碎片。 使用 28 的归一化碰撞能量和 22 ms 的最大注射时间以 15'000 的分辨率获取 HCD 光谱。 自动增益控制 (AGC) 设置为 100'000 个离子。 启用电荷状态筛选。 单个、未分配和高于七个的电荷状态均被拒绝。 仅选择强度高于 250'000 的前体进行 MS/MS。 先前选择用于 MS/MS 测量的前体质量在 30 秒内被排除在进一步选择之外，并且排除窗口设置为 10 ppm。 使用内部锁定质量校准在 m/z 371.1012 和 445.1200 上采集样品。

蛋白质鉴定和定量

获得的原始 MS 数据由 MaxQuant（版本 1.6.2.3）处理，然后使用集成的 Andromeda 搜索引擎进行蛋白质鉴定。 该分析在当地实验室信息管理系统（LIMS）上运行。 根据包含 Uniprot 人类参考蛋白质组（分类 9606，规范版本 20180703）和人类口腔微生物组数据库（http://www.homd.org/， 版本注释基因组 460+, 20180702)，连接到他们的反向诱骗 fasta 数据库和常见蛋白质污染物。 半胱氨酸的脲甲基化设置为固定修饰，而蛋氨酸氧化和N端蛋白质乙酰化设置为可变修饰。 酶特异性设置为胰蛋白酶/P，允许最小肽长度为 7 个氨基酸和最多两次漏切。 使用 MaxQuant Orbitrap 默认搜索设置。 肽的最大错误发现率 (FDR) 设置为 0.01，蛋白质的最大错误发现率设置为 0.05。 启用了 LFQ，并在运行之间应用了两分钟的匹配窗口。 在 MaxQuant 实验设计模板中，每个文件在实验设计中保持独立，以获得单独的定量值。

蛋白质强度和调节

R 包 prolfqua 中实现的一组 R 函数用于执行差异表达分析。 MaxQuant 报告的肽强度经过 log2 转换，然后进行 z 转换，以便样本均值和方差相等。 接下来，使用 Tukey 中值抛光从肽强度估计标准化蛋白质强度。 根据标准化蛋白质强度计算蛋白质对数倍变化。 对每种蛋白质拟合具有两个因素（时间和患者）的线性模型，并根据模型参数估计和测试组间差异。 使用经验贝叶斯方法调节方差估计，该方法利用高通量实验的并行结构，提高了零假设显着性检验的统计能力。 最后，使用 Benjamini 和 Hochberg 程序调整 p 值以获得 FDR。 当 FDR <0.05 时，考虑时间点（T1 与 T0、T6 与 T0 和 T6 与 T1）之间差异调节的蛋白质。 使用 R 函数“prcomp”进行主成分分析以实现可视化目的。

通路分析

差异调节的人类蛋白质（FDR <0.05）进一步接受 QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 应用程序（QIAGEN Inc.，https://digitalinsights.qiagen.com/IPA），以调查哪些疾病和生物过程受到调节的影响我们的蛋白质组数据集发生变化。 该分析基于调节蛋白与相关疾病或功能之间的预期因果效应。 IPA 是一种强大的生物信息学分析工具，基于 QIAGEN 的知识库，结合了来自期刊文章和数据库的科学和生物医学信息，可以解释各种组学表达数据并预测潜在的调控网络和因果关系。 2022 年 4 月 12 日，根据 T1 与 T0 和 T6 与 T0 的 log2 倍变化和 FDR 数据进行了核心分析，并确定了按 FDR 排名的最受监管的疾病和生物过程。 此外，应用 z 分数预测算法，对于 ≥2 或 ≤-2 的 z 分数，疾病或功能活动分别被分类为显着增加（正 z 分数）或减少（负 z 分数），并表示为具有不同正方形大小 (FDR) 和颜色（z 分数）的热图。 较大的方块表示数据集中的调节蛋白与特定疾病或功能之间有更显着的重叠，而方块颜色反映了疾病或功能的变化方向（橙色：增加，蓝色：减少）。 与特定疾病或功能相关的蛋白质以网络图的形式呈现，表明蛋白质功能、蛋白质调节（上调或下调）以及预测的关联/相互作用类型（间接或直接、激活或抑制）。

统计分析

R 包 prolfqua 中实现的一组 R 函数用于执行差异表达分析。 MaxQuant 报告的肽强度经过 log2 转换，然后进行 z 转换，以便样本均值和方差相等。 接下来，使用 Tukey 中值抛光从肽强度估计标准化蛋白质强度。 根据标准化蛋白质强度计算蛋白质对数倍变化。 对每种蛋白质拟合具有两个因素（时间和患者）的线性模型，并根据模型参数估计和测试组间差异。 使用经验贝叶斯方法调节方差估计，该方法利用高通量实验的并行结构，提高了零假设显着性检验的统计能力。 最后，使用 Benjamini 和 Hochberg 程序调整 p 值以获得 FDR。 当 FDR <0.05 时，考虑时间点（T1 与 T0、T6 与 T0 和 T6 与 T1）之间差异调节的蛋白质。 使用 R 函数“prcomp”进行主成分分析以实现可视化目的。