Speichelproteom als Reaktion auf eine nicht-chirurgische parodontale Behandlung

Studienpopulation und klinische Untersuchung

Insgesamt 10 systemisch gesunde und Nichtraucher-Personen mit Parodontitis im Stadium III, Grad C wurden an der Abteilung für Parodontologie, Fakultät für Zahnmedizin, Aydın Adnan Menderes Universität, Aydın, Türkei, rekrutiert.

Die parodontale Beurteilung des gesamten Mundes umfasste Messungen der Sondierungstiefe, des klinischen Attachmentverlusts, des Prozentsatzes der Stellen mit Blutungen bei der Sondierung, des Gingivaindex und des Plaqueindex zu Studienbeginn (T0) sowie einen Monat (T1) und sechs Monate (T6) nach der Behandlung . Alle Messungen wurden an 6 Stellen pro Zahn mit Ausnahme der dritten Molaren mithilfe einer manuellen parodontalen Sonde (William's periodontal probe, Hu-Friedy, Chicago, IL) durchgeführt. Die alveoläre Knochenresorption wurde bei jedem Teilnehmer auf dem digitalen Panorama-Röntgenbild beurteilt. Alle klinischen Messungen wurden von einem erfahrenen Parodontologen (B.A.) durchgeführt.

Die Diagnose einer Parodontitis im Stadium III, Grad C wurde gemäß den Kriterien durchgeführt, die im International Workshop on the Classification of Periodontal and Periimplant Diseases and Conditions 2017 vorgeschlagen wurden.

Behandlung

Zu Studienbeginn, nach Speichelsammlung und parodontaler Beurteilung, wurde eine konventionelle Quadrantenskalierung und Wurzelplanung (SRP) durchgeführt, beginnend mit dem oberen rechten Quadranten und dann im Uhrzeigersinn über vier Besuche in wöchentlichen Abständen fortgesetzt. Die SRP wurde unter örtlicher Betäubung vom selben Parodontologen (B.A.) unter Verwendung von Ultraschallinstrumenten (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) und manuellen parodontalen Küretten (Gracey Curets, Scaler Hu-Friedy, Chicago, IL) durchgeführt. Alle vorhandenen Zähne wurden so lange instrumentiert, bis die Wurzeloberfläche optisch und taktil sauber und glatt war. Selbst durchgeführte Maßnahmen zur Plaquekontrolle bestanden aus dem Zähneputzen mit der modifizierten Bass-Technik mit einer mittelgroßen Zahnbürste und einer normalen Zahnpasta mit Fluorid zweimal täglich sowie einer Interdentalreinigung mit Zahnseide und/oder Interdentalbürsten einmal täglich. Nach Abschluss der SRP wurden zu T1 und T6 Nachuntersuchungen von Speichelproben und parodontalen Untersuchungen durchgeführt.

Speichelprobenahme

Den Teilnehmern wurde morgens zwischen 8:00 und 10:00 Uhr zu T0, T1 und T6 nicht stimulierter Vollspeichel entnommen. Alle Patienten wurden gebeten, vor der Probenahme zwei Stunden lang auf Essen und Trinken sowie auf sämtliche Mundhygienemaßnahmen zu verzichten. Die Patienten wurden zunächst gebeten, ihren Mund mit Leitungswasser auszuspülen und 5 Minuten zu warten, um eine Probenverdünnung zu vermeiden. Über einen Zeitraum von 5 Minuten wurde nicht stimulierter Speichel gesammelt; Die Patienten wurden angewiesen, mit nach vorne geneigtem Kopf zu sitzen, um das passive Sabbern zu fördern, und in einen sterilen Universalbehälter aus Polypropylen zu spucken. Nach der Probenahme wurden die Proben sofort gekühlt (4 °C) gelagert, aliquotiert und bei -80 °C eingefroren, bis sie benötigt wurden.

Markierungsfreie quantitative proteomische Analyse

Speichelüberstandsproben, die bei T0, T1 und T6 (n = 30) gesammelt wurden, wurden unter Verwendung eines markierungsfreien quantitativen (LFQ) proteomischen Ansatzes analysiert.

Probenvorbereitung

Die Proben wurden mit einem kommerziellen iST-Kit (PreOmics, Deutschland) mit einer aktualisierten Version des Protokolls vorbereitet. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zürich, Schweiz) geschätzt. Für jede Probe wurden 50 µg Protein in die Kartusche überführt und durch Zugabe von 50 µL der „Digest“-Lösung aufgeschlossen. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37 °C wurde der Verdau mit 100 µL Stopplösung gestoppt. Die Lösungen in der Kartusche wurden durch Zentrifugation bei 3800 g entfernt, während die Peptide vom iST-Filter zurückgehalten wurden. Abschließend wurden die Peptide gewaschen, eluiert, getrocknet und in 20 µL Injektionspuffer (3 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) erneut gelöst.

Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

Die massenspektrometrische Analyse wurde mit einem Q Exactive HF-X-Massenspektrometer (Thermo Scientific) durchgeführt, das mit einer digitalen PicoView-Quelle (New Objective) ausgestattet und mit einem M-Class UPLC (Waters) gekoppelt war. Die Lösungsmittelzusammensetzung an den beiden Kanälen betrug 0,1 % Ameisensäure für Kanal A und 0,1 % Ameisensäure, 99,9 % Acetonitril für Kanal B. Für jede Probe wurden 2 μl Peptide auf eine kommerzielle MZ Symmetry C18 Trap-Säule (100 Å, 5 μm) geladen , 180 µm x 20 mm, Waters), gefolgt von einer nanoEase MZ C18 HSS T3-Säule (100 Å, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). Die Peptide wurden mit einer Flussrate von 300 nL/min durch einen Gradienten von 8 bis 27 % B in 85 min, 35 % B in 5 min und 80 % B in 1 min eluiert. Die Proben wurden in zufälliger Reihenfolge entnommen. Das Massenspektrometer wurde im datenabhängigen Modus (DDA) betrieben und erfasste nach der Akkumulation auf einen Zielwert ein Full-Scan-MS-Spektrum (350 – 1.400 m/z) mit einer Auflösung von 120.000 bei 200 m/z 3.000.000, gefolgt von einer HCD-Fragmentierung (Higher-Energy Collision Dissociation) auf den zwanzig intensivsten Signalen pro Zyklus. HCD-Spektren wurden mit einer Auflösung von 15.000 unter Verwendung einer normalisierten Kollisionsenergie von 28 und einer maximalen Injektionszeit von 22 ms aufgenommen. Die automatische Verstärkungsregelung (AGC) wurde auf 100.000 Ionen eingestellt. Die Ladezustandsüberprüfung wurde aktiviert. Einzelne, nicht zugewiesene und Ladezustände über sieben wurden abgelehnt. Für MS/MS wurden nur Vorläufer mit einer Intensität über 250.000 ausgewählt. Vorläufermassen, die zuvor für die MS/MS-Messung ausgewählt wurden, wurden 30 s lang von der weiteren Auswahl ausgeschlossen, und das Ausschlussfenster wurde auf 10 ppm eingestellt. Die Proben wurden mittels interner Lock-Massenkalibrierung bei m/z 371,1012 und 445,1200 erfasst.

Proteinidentifizierung und -quantifizierung

Die erfassten MS-Rohdaten wurden von MaxQuant (Version 1.6.2.3) verarbeitet, gefolgt von der Proteinidentifizierung mithilfe der integrierten Andromeda-Suchmaschine. Die Analyse wurde auf dem lokalen Laborinformationsmanagementsystem (LIMS) durchgeführt. Die Spektren wurden anhand einer Datenbank durchsucht, die das menschliche Uniprot-Referenzproteom (Taxonomie 9606, kanonische Version von 20180703) und die Human Oral Microbiome Database (http://www.homd.org/, Version annotierte Genome 460+, 20180702), verkettet mit ihrer umgekehrten Decoyed-Fasta-Datenbank und häufigen Proteinverunreinigungen. Die Carbamidomethylierung von Cystein wurde als feste Modifikation festgelegt, während die Methioninoxidation und die Acetylierung des N-terminalen Proteins als variabel festgelegt wurden. Die Enzymspezifität wurde auf Trypsin/P eingestellt, was eine minimale Peptidlänge von 7 Aminosäuren und maximal zwei fehlende Spaltungen ermöglichte. Es wurden die Standardsucheinstellungen von MaxQuant Orbitrap verwendet. Die maximale Falscherkennungsrate (FDR) wurde für Peptide auf 0,01 und für Proteine ​​auf 0,05 festgelegt. LFQ wurde aktiviert und ein Zwei-Minuten-Fenster für Spiele zwischen den Läufen wurde angewendet. In der experimentellen Entwurfsvorlage von MaxQuant wird jede Datei im experimentellen Entwurf separat gehalten, um individuelle quantitative Werte zu erhalten.

Proteinintensitäten und -regulierung

Zur Durchführung der Differenzialausdrucksanalyse wurde eine Reihe von R-Funktionen verwendet, die im R-Paket prolfqua implementiert sind. Die von MaxQuant gemeldeten Peptidintensitäten wurden log2-transformiert und dann z-transformiert, sodass die Stichprobenmittelwerte und -varianzen gleich waren. Als nächstes wurden normalisierte Proteinintensitäten aus den Peptidintensitäten unter Verwendung der Tukey-Medianpolitur geschätzt. Die log2-fachen Änderungen des Proteins wurden basierend auf normalisierten Proteinintensitäten berechnet. An jedes Protein wurde ein lineares Modell mit zwei Faktoren (Zeit und Patient) angepasst und anhand der Modellparameter wurden Gruppenunterschiede geschätzt und getestet. Die Varianzschätzungen wurden mithilfe des empirischen Bayes-Ansatzes moderiert, der die parallele Struktur des Hochdurchsatzexperiments nutzt, wodurch die statistische Aussagekraft des Nullhypothese-Signifikanztests erhöht wird. Schließlich wurden die p-Werte mithilfe des Benjamini- und Hochberg-Verfahrens angepasst, um die FDRs zu erhalten. Unterschiedlich regulierte Proteine ​​zwischen den Zeitpunkten (T1 vs. T0, T6 vs. T0 und T6 vs. T1) wurden bei FDR <0,05 berücksichtigt. Die Hauptkomponentenanalyse wurde zu Visualisierungszwecken mit der R-Funktion „prcomp“ durchgeführt.

Pathway-Analyse

Differenziell regulierte menschliche Proteine ​​(FDR <0,05) wurden außerdem der QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA)-Anwendung (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) unterzogen, um zu untersuchen, welche Krankheiten und biologischen Prozesse von der Regulierung betroffen waren Änderungen in unserem Proteomdatensatz. Die Analyse basiert auf erwarteten kausalen Wirkungen zwischen regulierten Proteinen und damit verbundenen Krankheiten oder Funktionen. IPA ist ein leistungsstarkes bioinformatisches Analysetool, das auf der Knowledge Base von QIAGEN basiert und wissenschaftliche und biomedizinische Informationen aus Zeitschriftenartikeln und Datenbanken kombiniert. Das ermöglicht die Interpretation einer breiten Palette von Omics-Expressionsdaten und Vorhersagen potenzieller regulatorischer Netzwerke und kausaler Zusammenhänge. Am 12. April 2022 wurde eine Kernanalyse auf der Grundlage der log2-fachen Änderung und der FDR-Daten für T1 vs. T0 und T6 vs. T0 durchgeführt und die nach FDR am häufigsten regulierten Krankheiten und biologischen Prozesse identifiziert. Darüber hinaus wurde ein Z-Score-Vorhersagealgorithmus angewendet und Krankheiten oder funktionelle Aktivitäten wurden als signifikant erhöht (positive Z-Scores) oder verringert (negative Z-Scores) für Z-Scores von ≥2 bzw. ≤-2 kategorisiert und als dargestellt Heatmaps mit unterschiedlichen Quadratgrößen (FDR) und Farben (Z-Scores). Größere Quadrate weisen auf eine stärkere Überlappung zwischen den regulierten Proteinen im Datensatz und einer bestimmten Krankheit oder Funktion hin, während die Farben der Quadrate die Richtung der Veränderung bei einer Krankheit oder Funktion widerspiegeln (orange: erhöht, blau: verringert). Mit einer bestimmten Krankheit oder Funktion assoziierte Proteine ​​wurden als Netzwerkdiagramme dargestellt, die die Proteinfunktion, die Proteinregulierung (hoch- oder herunterreguliert) und die vorhergesagte Art der Assoziation/Interaktion (indirekt oder direkt, Aktivierung oder Hemmung) anzeigen.

Statistische Analyse

Zur Durchführung der Differenzialausdrucksanalyse wurde eine Reihe von R-Funktionen verwendet, die im R-Paket prolfqua implementiert sind. Die von MaxQuant gemeldeten Peptidintensitäten wurden log2-transformiert und dann z-transformiert, sodass die Stichprobenmittelwerte und -varianzen gleich waren. Als nächstes wurden normalisierte Proteinintensitäten aus den Peptidintensitäten unter Verwendung der Tukey-Medianpolitur geschätzt. Die log2-fachen Änderungen des Proteins wurden basierend auf normalisierten Proteinintensitäten berechnet. An jedes Protein wurde ein lineares Modell mit zwei Faktoren (Zeit und Patient) angepasst und anhand der Modellparameter wurden Gruppenunterschiede geschätzt und getestet. Die Varianzschätzungen wurden mithilfe des empirischen Bayes-Ansatzes moderiert, der die parallele Struktur des Hochdurchsatzexperiments nutzt, wodurch die statistische Aussagekraft des Nullhypothese-Signifikanztests erhöht wird. Schließlich wurden die p-Werte mithilfe des Benjamini- und Hochberg-Verfahrens angepasst, um die FDRs zu erhalten. Unterschiedlich regulierte Proteine ​​zwischen den Zeitpunkten (T1 vs. T0, T6 vs. T0 und T6 vs. T1) wurden bei FDR <0,05 berücksichtigt. Die Hauptkomponentenanalyse wurde zu Visualisierungszwecken mit der R-Funktion „prcomp“ durchgeführt.