Spytproteom som svar på ikke-kirurgisk periodontal behandling

Studiepopulation og klinisk undersøgelse

I alt 10 systemisk sunde og ikke-rygere individer med stadium III, grad C parodontitis blev rekrutteret ved Department of Parodontology, School of Dentistry, Aydın Adnan Menderes University, Aydın, Tyrkiet.

Fuld-mund parodontal vurdering inkluderede målinger af sonderingsdybde, klinisk tilknytningstab, procentdelen af ​​steder med blødning ved sondering, tandkødsindeks og plakindeks ved baseline (T0) og en måned (T1) og seks måneder (T6) efter behandling . Alle målinger blev opnået fra 6 steder pr. tand, ekskl. tredje kindtænder under anvendelse af en manuel periodontal probe (William's periodontal probe, Hu-Friedy, Chicago, IL). Den alveolære knogleresorption blev vurderet på det digitale panorama røntgenbillede hos hver deltager. Alle kliniske målinger blev udført af en erfaren parodontist (B.A.).

Diagnose af trin III, grad C paradentose blev udført i henhold til kriterierne foreslået af 2017 International Workshop om klassificering af periodontale og peri-implantatsygdomme og tilstande.

Behandling

Konventionel kvadrantvis skalering og rodplaning (SRP) blev udført ved baseline, efter spytopsamling og periodontal vurdering, startende med den øverste højre kvadrant og fortsatte med uret over fire besøg med ugentlige intervaller. SRP blev udført under lokalbedøvelse af den samme parodontist (B.A.) ved brug af ultralydsinstrumenter (Mini Piezon, EMS, Nyon, CH) og manuelle parodontale curetter (Gracey curets, scaler Hu-Friedy, Chicago, IL). Alle tilstedeværende tænder blev instrumenteret, indtil rodoverfladen var visuelt og taktilt ren og glat. Selvudførte plakkontrolforanstaltninger bestod af tandbørstning ved hjælp af den modificerede Bass-teknik med en mellemtandbørste og en almindelig tandpasta med fluor to gange dagligt og interdental rengøring med tandtråd og/eller interdentale børster en gang dagligt. Opfølgende spytprøvetagning og periodontale vurderinger blev udført ved T1 og T6 efter at have afsluttet SRP.

Spytprøvetagning

Ustimuleret hel spyt blev opnået fra deltagerne om morgenen mellem 8:00 - 10:00 ved T0, T1 og T6. Alle patienter blev bedt om at afholde sig fra at spise, drikke og alle mundhygiejneprocedurer i 2 timer før prøvetagning. Patienterne blev først bedt om at skylle munden med postevand og vente i 5 minutter for at undgå prøvefortynding. Ustimuleret spyt blev opsamlet over en 5-minutters periode; patienterne blev bedt om at sidde med hovedet vippet fremad for at tilskynde til passiv savlen og opspytte ind i et sterilt universelt polypropylenbeholderrør. Efter prøveudtagning blev prøver straks overført til køleopbevaring (4 °C), alikvoteret og frosset ved -80 °C, indtil de skulle bruges.

Etiketfri kvantitativ proteomisk analyse

Spytsupernatantprøver opsamlet ved T0, T1 og T6 (n = 30) blev analyseret ved hjælp af en mærkefri kvantitativ (LFQ) proteomisk tilgang.

Prøveforberedelse

Prøver blev forberedt ved at bruge et kommercielt iST Kit (PreOmics, Tyskland) med en opdateret version af protokollen. Proteinkoncentrationen blev estimeret ved hjælp af Qubit® Protein Assay Kit (Life Technologies, Zürich, Schweiz). For hver prøve blev 50 µg protein overført til patronen og fordøjet ved at tilsætte 50 µL af 'Digest'-opløsningen. Efter 60 minutters inkubation ved 37 °C blev fordøjelsen standset med 100 µL Stop-opløsning. Opløsningerne i patronen blev fjernet ved centrifugering ved 3800 g, mens peptiderne blev tilbageholdt af iST-filteret. Til sidst blev peptiderne vasket, elueret, tørret og resolubiliseret i 20 µl injektionsbuffer (3 % acetonitril, 0,1 % myresyre).

Væskekromatografi-massespektrometrianalyse

Massespektrometrianalyse blev udført på et Q Exactive HF-X massespektrometer (Thermo Scientific) udstyret med en Digital PicoView-kilde (New Objective) og koblet til en M-klasse UPLC (Waters). Opløsningsmiddelsammensætningen ved de to kanaler var 0,1% myresyre for kanal A og 0,1% myresyre, 99,9% acetonitril for kanal B. For hver prøve blev 2 μL peptider påsat en kommerciel MZ Symmetry C18 Trap Column (100Å, 5 µm) , 180 µm x 20 mm, Waters) efterfulgt af nanoEase MZ C18 HSS T3-søjle (100Å, 1,8 µm, 75 µm x 250 mm, Waters). Peptiderne blev elueret ved en strømningshastighed på 300 nL/min med en gradient fra 8 til 27% B i 85 min, 35% B i 5 min og 80% B i 1 min. Prøver blev erhvervet i en randomiseret rækkefølge. Massespektrometeret blev betjent i dataafhængig tilstand (DDA) og opnåede et fuld-scan MS-spektre (350 - 1'400 m/z) ved en opløsning på 120'000 ved 200 m/z efter akkumulering til en målværdi på 3.000.000, efterfulgt af HCD (higher-energy collision dissociation) fragmentering på de tyve mest intense signaler pr. cyklus. HCD-spektre blev opnået med en opløsning på 15.000 ved brug af en normaliseret kollisionsenergi på 28 og en maksimal injektionstid på 22 ms. Den automatiske forstærkningskontrol (AGC) blev indstillet til 100.000 ioner. Screening af ladetilstand blev aktiveret. Enkelt-, ikke-tildelte og debiteringstilstande højere end syv blev afvist. Kun prækursorer med intensitet over 250.000 blev udvalgt til MS/MS. Precursormasser, der tidligere var udvalgt til MS/MS-måling, blev udelukket fra yderligere udvælgelse i 30 s, og eksklusionsvinduet blev sat til 10 ppm. Prøverne blev erhvervet ved hjælp af intern låsemassekalibrering på m/z 371.1012 og 445.1200.

Protein identifikation og kvantificering

De erhvervede rå MS-data blev behandlet af MaxQuant (version 1.6.2.3), efterfulgt af proteinidentifikation ved hjælp af den integrerede Andromeda-søgemaskine. Analysen blev kørt på det lokale laboratorieinformationsstyringssystem (LIMS). Spektre blev søgt mod en database indeholdende Uniprot human reference proteom (taksonomi 9606, kanonisk version fra 20180703) og Human oral Microbiome Database (http://www.homd.org/, version annoterede genomer 460+, 20180702), sammenkædet til deres omvendt lokkede fasta-database og almindelige proteinkontaminanter. Carbamidomethylering af cystein blev sat som fast modifikation, mens methioninoxidation og N-terminal proteinacetylering blev indstillet som variable. Enzymspecificitet blev sat til trypsin/P, hvilket tillader en minimal peptidlængde på 7 aminosyrer og maksimalt to manglende spaltninger. MaxQuant Orbitrap standard søgeindstillinger blev brugt. Den maksimale falske opdagelsesrate (FDR) blev sat til 0,01 for peptider og 0,05 for proteiner. LFQ blev aktiveret, og et to-minutters vindue for kampe mellem løb blev anvendt. I MaxQuant eksperimentelle designskabelonen holdes hver fil adskilt i det eksperimentelle design for at opnå individuelle kvantitative værdier.

Proteinintensitet og regulering

Et sæt R-funktioner implementeret i R-pakken prolfqua blev brugt til at udføre den differentielle ekspressionsanalyse. Peptidintensiteterne rapporteret af MaxQuant blev log2-transformeret og derefter z-transformeret, således at prøvemiddelværdierne og varianserne var ens. Dernæst blev normaliserede proteinintensiteter estimeret ud fra peptidintensiteterne under anvendelse af Tukeys medianpolering. Protein log2-fold ændringer blev beregnet baseret på normaliserede proteinintensiteter. En lineær model med to faktorer (tid og patient) blev tilpasset til hvert protein, og gruppeforskelle blev estimeret og testet baseret på modelparametrene. Variansestimaterne blev modereret ved hjælp af den empiriske Bayes-tilgang, som udnytter den parallelle struktur af højgennemstrømningseksperimentet, hvilket øger den statistiske styrke af nulhypotesens signifikanstest. Til sidst blev p-værdierne justeret ved hjælp af Benjamini og Hochberg-proceduren for at opnå FDR'erne. Differentielt regulerede proteiner mellem tidspunkterne (T1 vs T0, T6 vs T0 og T6 vs T1) blev betragtet ved FDR <0,05. Principal komponentanalyse blev udført til visualiseringsformål ved brug af R-funktionen 'prcomp'.

Baneanalyse

Differentielt regulerede humane proteiner (FDR <0,05) blev yderligere underkastet QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis (IPA)-applikationen (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/IPA) for at undersøge, hvilke sygdomme og biologiske processer der var påvirket af regulatoriske ændringer i vores proteomdatasæt. Analysen er baseret på forventede kausale virkninger mellem regulerede proteiner og associerede sygdomme eller funktioner. IPA er et kraftfuldt bioinformatisk analyseværktøj, baseret på QIAGENs vidensbase, der kombinerer videnskabelig og biomedicinsk information fra tidsskriftsartikler og databaser, som giver mulighed for fortolkning af en bred vifte af omics-udtryksdata og forudsigelser af potentielle regulatoriske netværk og årsagssammenhænge. En kerneanalyse blev udført den 12. april 2022 baseret på log2-fold ændring og FDR-data for T1 vs T0 og T6 vs T0, og de topregulerede sygdoms- og biologiske processer rangeret efter FDR blev identificeret. Desuden blev der anvendt en z-score forudsigelsesalgoritme, og sygdom eller funktionelle aktiviteter blev kategoriseret som signifikant øget (positive z-scores) eller reduceret (negative z-scores) for z-scores på henholdsvis ≥2 eller ≤-2 og præsenteret som heatmaps med forskellige kvadratstørrelser (FDR) og farver (z-scores). Større firkanter indikerer et mere signifikant overlap mellem de regulerede proteiner i datasættet og en specifik sygdom eller funktion, mens firkantede farver afspejler ændringsretningen for en sygdom eller funktion (orange: øget, blå: nedsat). Proteiner forbundet med en specifik sygdom eller funktion blev præsenteret som netværksdiagrammer, der indikerer proteinfunktion, proteinregulering (op- eller nedreguleret) og den forudsagte type association/interaktion (indirekte eller direkte, aktivering eller hæmning).

Statistisk analyse

Et sæt R-funktioner implementeret i R-pakken prolfqua blev brugt til at udføre den differentielle ekspressionsanalyse. Peptidintensiteterne rapporteret af MaxQuant blev log2-transformeret og derefter z-transformeret, således at prøvemiddelværdierne og varianserne var ens. Dernæst blev normaliserede proteinintensiteter estimeret ud fra peptidintensiteterne under anvendelse af Tukeys medianpolering. Protein log2-fold ændringer blev beregnet baseret på normaliserede proteinintensiteter. En lineær model med to faktorer (tid og patient) blev tilpasset til hvert protein, og gruppeforskelle blev estimeret og testet baseret på modelparametrene. Variansestimaterne blev modereret ved hjælp af den empiriske Bayes-tilgang, som udnytter den parallelle struktur af højgennemstrømningseksperimentet, hvilket øger den statistiske styrke af nulhypotesens signifikanstest. Til sidst blev p-værdierne justeret ved hjælp af Benjamini og Hochberg-proceduren for at opnå FDR'erne. Differentielt regulerede proteiner mellem tidspunkterne (T1 vs T0, T6 vs T0 og T6 vs T1) blev betragtet ved FDR <0,05. Principal komponentanalyse blev udført til visualiseringsformål ved brug af R-funktionen 'prcomp'.