搾りかす油の摂取によるアルツハイマー病患者の食後の炎症過程の軽減 (CORDIAL)

1. 背景

   アルツハイマー病（AD）は認知症の最も一般的な原因であり、その有病率は2050年までに4倍になると予想されています。 アルツハイマー病は、アミロイド ベータ (Aβ) および過剰リン酸化タウ タンパク質が豊富に含まれるタンパク質沈着物の脳血管および実質への蓄積に関連する、実質的な神経細胞の喪失と慢性炎症によって病理学的に特徴付けられます。 中枢神経系を末梢循環から分離する血液脳関門機能の破壊が、アルツハイマー病の発症リスクを高め、経過を悪化させる可能性があることを示唆する証拠が蓄積されている。

   ミクログリアは、脳の恒常性の変化を検出すると活性化されるため、ほとんどの神経病理学において重要な役割を果たすことが提案されています。 この細胞タイプは脳内に常在するマクロファージのように機能し、感染や傷害の兆候がないか局所の微小環境を常にスキャンし、見つかると活性化します。 その結果、サイトカイン、活性酸素種 (ROS)、一酸化窒素などの多くの炎症誘発性メディエーターが放出されます。 対照的に、アルツハイマー病患者では、グルタチオンペルオキシダーゼ-1 やスーパーオキシドジスムターゼ-1 などの抗酸化防御システムが低下しています。

   血漿 Aβ の重要な部分は、肝細胞および腸細胞から分泌されるトリグリセリドに富むリポタンパク質 (TRL) に関連しています。 これらの粒子は、食後脂質異常症の指標として機能するアポリポタンパク質 B によって特徴付けられます。食後脂質異常症は、食事の脂肪吸収後の TRL の誇張的ではあるが一時的な増加であり、アテローム性動脈硬化症の形成につながります。 この現象は、心血管疾患とアルツハイマー病との関連性がある可能性があります。 このような関連性の存在は臨床研究や横断研究ですでに実証されていますが、根底にあるメカニズムは依然として不明です。

   食事による脂肪摂取がアルツハイマー病の発症と進行に関連しているという証拠が蓄積されています。 したがって、飽和脂肪酸（SFA）の摂取は、脂質異常症、内皮機能不全、炎症、酸化ストレスを促進する有害な因子となります。 対照的に、多価不飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸（PUFA および MUFA）が豊富な脂肪の摂取は、おそらく全身性炎症レベルの低下の結果として、疾患有病率の低下と関連しています。

   オリーブ搾りかす油は、溶媒抽出または遠心分離によってオリーブ油製造の固体副産物から得られます。 この副産物の保存期間により、バージン オリーブ オイルには微量にしか含まれない、生物活性の点で非常に興味深い果物の皮や木の葉の成分をオイルに濃縮することができます。 したがって、遠心分離されたオリーブ搾りかす油には、脂溶性の不ケン化画分の成分が豊富に含まれています。 これらの化合物の一部は精製中に失われますが、穏やかな精製条件下では適切な濃度で保持されます。 これらの成分には、ステロールやトコフェロール、トリテルペン酸であるオレアノール酸やマスリン酸が含まれます。

   以前の in vitro 研究で、研究者らは、オリーブ搾りかす油のα-トコフェロール、オレアノール酸、β-シトステロールに含まれる生理活性化合物が、単独でも、人工トリグリセリドリッチリポタンパク質（TRL）の一部としても、ミクログリアの活性化を弱めることができることを実証しました。 ミクログリアの減衰は、過剰活性化を引き起こす刺激を受けたときに細胞によって放出される、炎症および酸化ストレスのさまざまなマーカーを測定することによって決定されました。 この発見は、これらの生理活性化合物が脳に到達すれば、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発症を予防または遅らせるのに役立つ可能性への扉を開きました。

   次に、研究者らは、オリーブ搾りかす油摂取後に得られたヒトTRLが、高オレイン酸ヒマワリ油摂取後に得られたものよりもミクログリアの活性化を大幅に減衰させることができるかどうかを決定するために、食後比較研究を実施した。 研究者らは、食後の特定の時間帯において、TRLで処理したミクログリア細胞による炎症および酸化ストレスのマーカーの放出が、オリーブ搾りかす油の摂取に由来する場合に低いことを発見した。 したがって、健康な被験者では、食後の搾りかす油の摂取により、その生理活性化合物を運ぶリポタンパク質が生成され、これらがミクログリアの活性化の減弱に関与することが証明されました。

   その結果、研究者らは、記憶障害や初期の認知障害を示すアルツハイマー病と診断された患者を対象に、我々の仮説を検証する時期が来たと考えている。 このプロジェクトでは、研究者らは、これらの患者は食後の脂質代謝に変化があり、その結果、ミクログリアを過剰活性化する能力がより高いTRLになるが、搾りかす油の摂取によりこの活性化が弱まるのではないかと仮説を立てている。 これが事実であれば、搾りかす油の摂取がミクログリアの過剰活性化によって引き起こされる神経炎症を予防し、アルツハイマー病の発症および進行のリスクを軽減する可能性があることを示唆しています。

2. 作業仮説

   このプロジェクトは、TRL (人工およびヒト由来の両方) が、アルツハイマー病などの神経変性疾患に関連する現象であるミクログリアの活性化を誘発できるという実証に基づいています。 さらに、オリーブ搾りかす油とその生理活性化合物の摂取は、この活性化を弱めることができることが示されています。 この研究プロジェクトのアプローチは、アルツハイマー病患者によるオリーブ搾りかす油の摂取が、これらの生理活性化合物を維持し、ミクログリアの活性化と炎症に対する保護能力を維持する食後のTRLの形成につながるというものです。

   これが事実であれば、得られた証拠は、食後の期間に形成されるTRLの影響に基づいた、アルツハイマー病の予防と治療に使用できる搾りかす油の新しい健康用途の開発の基礎を築くことになるでしょう。病気。

3. 目的

上記の仮説を検証するために、次の特定の目的に取り組みます。

1. 軽度または初期段階でアルツハイマー病と診断された患者における食後の脂質代謝の変化の可能性を判断する。
2. 高オレイン酸ヒマワリ油と比較して、搾りかす油の摂取が食後の脂質代謝におけるこれらの変化を正常化できるかどうかを評価する。
3. 搾りかす油または高オレイン酸ヒマワリ油の摂取後に得られるヒトTRLを取得し、特性評価すること。
4. 高オレイン酸ヒマワリ油と比較して、搾りかす油の摂取後に得られるTRLによるミクログリア活性化の減弱効果を評価する。

4. 実験計画と活動

この研究は、アルツハイマー病患者を対象とした無作為化二重盲検食後クロスオーバー試験として設計されており、アルツハイマー病患者は無作為に2つのグループに分けられ、同年齢の健康な対照者と比較される。 すべての被験者には搾りかす油と高オレイン酸ヒマワリ油が与えられます。

アクティビティ 1. 生物活性化合物が豊富な搾りかす油を入手する

オリーブ搾りかす油はORIVAによって提供され、高オレイン酸ひまわり油は市販品となります。 両方のオイルは、酸性アルコール、トリテルペンアルコール、トコフェロール、ステロールの含有量を決定するために、Instituto de la Grasa-CSIC で特性評価されます。

アクティビティ 2. ボランティアの選択と実験用オイルの管理

サブアクティビティ 2.1. ボランティアの選考

食後治験はヘルシンキ宣言、欧州評議会条約、ユネスコ世界宣言の基本原則に従って実施され、セビリアのビルヘン・デ・ヴァルメ病院の神経内科で行われる。 成人ボランティアは、標準的な基準および特定のバイオマーカーを使用した臨床検査および認知検査の結果に基づいて、アルツハイマー病と診断された人から選ばれます。 参加基準には、適切な視覚および聴覚能力、医療従事者による病気の進行の追跡記録も含まれます。 除外基準には、臨床的に重大な精神障害が含まれます。安全性に影響を与える可能性のある全身疾患または感染症。過去2年以内に心血管疾患を患っている。過去6か月以内に高血圧がコントロールされていない。過去5年以内のがん。過去 2 年以内の薬物またはアルコールの乱用。そしてインスリン依存性糖尿病。

参加するには、個人は口頭と書面の両方で説明を受けた後、ビルヘン・ド・ヴァルメ病院の倫理委員会によって承認されたプロトコールに書面による同意を与えることも求められる。 被験者には、試験実施の前日はアルコール飲料とタバコの摂取を避けることが奨励される。

サブアクティビティ 2.2. サンプルサイズの決定。 この研究で調べる定量的変数は、食後の血漿トリグリセリド濃度です。 高オレイン酸ヒマワリ油と比較して、オリーブ搾りかす油摂取の結果としてトリグリセリド濃度が少なくとも 10 % 減少すると仮定し、研究の安全性 95 % (リスク α 0.05; zα 1.645) と検出力 90 % を考慮します。 (zβ 1.282)、16 人のボランティアのサンプルサイズが得られます。 ボランティアの拒否の可能性があるため（悪影響は予想されませんが）、サンプルサイズを各グループあたり 20 人の被験者に増やすことが賢明であると考えられます。

サブアクティビティ 2.3. 実験食の投与 試験当日、12 時間一晩絶食した後、各参加者は肘静脈を穿刺して血液サンプルを採取します。 その後、被験者には搾りかすオリーブオイルまたは高オレイン酸ヒマワリ油が投与され、コーヒーまたは牛乳と全粒粉パンでトーストを含む朝食の一部として摂取されます。 摂取後、各参加者は食後 7 時間にわたって 1 時間ごとに血液のアリコートを採取されます。 この期間中は、水の摂取は自由に許可されます。

アクティビティ 3. ヒトトリグリセリド豊富リポタンパク質 (TRL) の単離と特性評価

サブアクティビティ 3.1. 血清中の測定 得られた肘部血液のアリコートから、遠心分離によって血清を取得し、タンパク質分解を避けるために、NaN3、PMSF、およびアプロチニンを防腐剤として添加するものとする。 血清は分析まで -80 °C で保存されます。 血清中のトリグリセリド濃度は分光光度法によって測定され、アポリポタンパク質 B 濃度は免疫比濁法によって測定されます。 これらの測定により、食後の TRL 形成とクリアランスの進行をモニタリングできます。 さらに、オレアノール酸、α-トコフェロール、β-シトステロールの血清濃度が測定されます。 トリテルペンの同定と定量のために私たちの研究室で開発された GC-MS メソッドを使用して、分析抽出および分別システムが続きます。

サブアクティビティ 3.2. トリグリセリドに富むリポタンパク質 (TRL) の単離と特性評価 食後アッセイで得られた血清の超遠心分離によって単離された TRL 中のオレアノール酸の存在を調査します。 カイロミクロンおよび VLDL の存在のマーカーとして、脂肪酸および TG 含有量、およびアポ B48 および B100 が ELISA によって測定されます。 これらの同じ粒子は、ミクログリア活性化研究 (アクティビティ 4) に使用されます。

アクティビティ 4. ヒト TRL 処理 BV-2 細胞におけるミクログリアの活性化 このアクティビティでは、マウス細胞株 BV-2 をミクログリア細胞モデルとして使用します。 この細胞タイプは、10% 熱不活化 FBS、ストレプトマイシン (100 mg/ml)、およびペニシリン (100 IU/ml) を添加した DMEM 培地で、湿度 100%、CO2 5% で培養します。 実験は 5% FBS 低減培地で行われます。 細胞は食後アッセイで得られた TRL で処理されます。 治療は24時間継続されます。

サブアクティビティ 4.1. 細胞生存率に対するヒトTRLの影響 まず、細胞生存率をMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム)法により測定する。 24 時間インキュベートした後、細胞を 5% FBS を補充した新鮮な培地で洗浄し、TRL で 12、24、および 36 時間処理します。 細胞は、5% FBS を補充した新鮮な培地で洗浄し、TRL で 12、24、および 36 時間処理します。 次に、MTT 溶液を追加します。 得られたホルマザン沈殿物を DMSO に溶解し、490 nm での吸光度を測定することで細胞生存率を定量します。

サブアクティビティ 4.2. ROS 産生と酸化還元活性に対する影響 細胞膜を横切って拡散し、細胞内エステラーゼによって加水分解されて非蛍光 DCFH を形成する蛍光プローブ 2',7'-ジクロロフルオレセイン-ジアセテート (DCFH-DA) を使用して、 ROS の細胞内濃度。 ROS の存在下では、DCFH は急速に酸化されて、高蛍光性のジクロロフルオレセイン (DCF) を形成します。 放出される蛍光の強度 (485 nm 励起、825 nm 発光) は、ROS の細胞内濃度に比例します。

総グルタチオンおよび酸化グルタチオンは、GSH とジチオニトロ安息香酸 (DTNB) によって形成される複合体を分光光度法でモニターする NADPH 依存性 GSSG レダクターゼ活性に基づく酵素法によって測定されます。

サブアクティビティ 4.3. サイトカイン産生に対するヒト TRL の影響 BV-2 細胞を食後 TRL で処理し、培養上清中の炎症促進性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの産生を、製造業者のプロトコールに従って市販の ELISA キットを使用して測定します。

サブアクティビティ 4.4. サイトカイン遺伝子発現に対するヒト TRL の影響 BV-2 細胞は食後の TRL で処理され、mRNA が単離されます。 目的のサイトカインの遺伝子発現を決定するには、この目的のために設計されたプライマーを使用して、cDNA への逆転写後のリアルタイム PCR 技術が使用されます。