Abschwächung postprandialer Entzündungsprozesse bei Alzheimer-Patienten durch den Verzehr von Tresteröl (CORDIAL)

1. HINTERGRUND

   Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Ursache für Demenz und ihre Prävalenz wird sich voraussichtlich bis 2050 vervierfachen. Die Alzheimer-Krankheit ist pathologisch durch einen erheblichen neuronalen Verlust und eine chronische Entzündung gekennzeichnet, die mit einer zerebrovaskulären und parenchymalen Ansammlung von Proteinablagerungen verbunden ist, die mit Amyloid-beta (Aβ) und hyperphosphoryliertem Tau-Protein angereichert sind. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass eine Störung der Funktion der Blut-Hirn-Schranke, die das Zentralnervensystem vom peripheren Kreislauf trennt, das Risiko für den Ausbruch der Alzheimer-Krankheit erhöhen und den Verlauf verschlechtern kann.

   Man geht davon aus, dass Mikroglia bei den meisten Neuropathologien eine entscheidende Rolle spielen, da sie bei Erkennung von Veränderungen in der Gehirnhomöostase aktiviert werden. Dieser Zelltyp verhält sich wie im Gehirn ansässige Makrophagen, die die lokale Mikroumgebung ständig nach Anzeichen einer Infektion und Verletzung absuchen und aktiviert werden, wenn sie gefunden werden. Dadurch wird eine Vielzahl entzündungsfördernder Mediatoren freigesetzt, darunter Zytokine, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Stickoxid. Im Gegensatz dazu sind antioxidative Abwehrsysteme wie Glutathionperoxidase-1 und Superoxiddismutase-1 bei AD-Patienten vermindert.

   Ein erheblicher Teil des Plasma-Aβ ist mit triglyceridreichen Lipoproteinen (TRL) assoziiert, die von Hepatozyten und Enterozyten sezerniert werden. Diese Partikel sind durch Apolipoprotein B gekennzeichnet, das als Indikator für eine postprandiale Dyslipidämie dient, bei der es sich um einen übertriebenen, aber vorübergehenden Anstieg des TRL nach der Aufnahme von Nahrungsfetten handelt, der zur Bildung von Arteriosklerose führt. Dieses Phänomen könnte der Zusammenhang zwischen Herz-Kreislauf-Erkrankungen und der Alzheimer-Krankheit sein. Die Existenz eines solchen Zusammenhangs wurde bereits in klinischen Studien und Querschnittsstudien nachgewiesen, der zugrunde liegende Mechanismus bleibt jedoch unklar.

   Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Aufnahme von Nahrungsfett mit dem Ausbruch und dem Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zusammenhängt. Somit wäre die Aufnahme gesättigter Fettsäuren (SFA) ein schädlicher Faktor, der Dyslipidämie, endotheliale Dysfunktion, Entzündungen und oxidativen Stress begünstigen würde. Im Gegensatz dazu ist der Verzehr von Fetten, die reich an mehrfach oder einfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA und MUFA) sind, mit einer geringeren Krankheitsprävalenz verbunden, wahrscheinlich als Folge eines geringeren Ausmaßes systemischer Entzündungen.

   Oliventresteröl wird aus dem festen Nebenprodukt der Olivenölproduktion durch Lösungsmittelextraktion oder Zentrifugation gewonnen. Die Lagerung dieses Nebenprodukts ermöglicht die Anreicherung des Öls mit den Bestandteilen der Fruchtschalen und Baumblätter, die aufgrund ihrer biologischen Aktivität von großem Interesse sind und in nativem Olivenöl nur in Spuren vorkommen. Dadurch wird zentrifugiertes Oliventresteröl mit fettlöslichen Bestandteilen der unverseifbaren Fraktion angereichert. Obwohl ein Teil dieser Verbindungen bei der Raffination verloren geht, können sie unter milden Raffinationsbedingungen in relevanten Konzentrationen erhalten bleiben. Zu diesen Bestandteilen gehören Sterole und Tocopherole sowie die Triterpensäuren Oleanolsäure und Maslinsäure.

   In früheren In-vitro-Studien zeigten die Forscher, dass die bioaktiven Verbindungen Alpha-Tocopherol, Oleanolsäure und Beta-Sitosterin im Oliventresteröl die Mikroglia-Aktivierung abschwächen konnten, sowohl isoliert als auch als Teil künstlicher triglyceridreicher Lipoproteine ​​(TRL). Die Mikroglia-Abschwächung wurde durch die Messung verschiedener Marker für Entzündung und oxidativen Stress bestimmt, die von der Zelle freigesetzt werden, wenn sie einer Stimulation ausgesetzt wird, die zu einer Überaktivierung führt. Dieser Befund eröffnete die Möglichkeit, dass diese bioaktiven Verbindungen, wenn sie das Gehirn erreichen, dazu beitragen könnten, die Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit zu verhindern oder zu verlangsamen.

   Anschließend führten die Forscher eine vergleichende postprandiale Studie durch, um festzustellen, ob menschliche TRL, die nach der Einnahme von Oliventresteröl gewonnen wurden, die Mikroglia-Aktivierung stärker abschwächen konnten als solche, die nach der Einnahme von Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt erhalten wurden. Die Forscher fanden heraus, dass zu bestimmten Zeiten während der postprandialen Phase die Freisetzung von Markern für Entzündung und oxidativen Stress durch mit TRL behandelte Mikrogliazellen geringer war, wenn sie aus der Einnahme von Oliventresteröl stammten. So wurde gezeigt, dass bei gesunden Probanden der Verzehr von Tresteröl in der postprandialen Phase zur Produktion von Lipoproteinen führt, die seine bioaktiven Verbindungen tragen, und dass diese an der Abschwächung der Mikroglia-Aktivierung beteiligt sind.

   Daher glauben die Forscher, dass es an der Zeit ist, unsere Hypothese bei Patienten mit diagnostizierter Alzheimer-Krankheit zu testen, die Gedächtnisprobleme oder eine beginnende kognitive Beeinträchtigung aufweisen. Für dieses Projekt gehen die Forscher davon aus, dass bei diesen Patienten Veränderungen im postprandialen Lipidstoffwechsel auftreten, die zu TRL mit einer größeren Fähigkeit zur Überaktivierung von Mikroglia führen, dass die Einnahme von Tresteröl diese Aktivierung jedoch abschwächt. Wenn dies der Fall ist, würde dies darauf hindeuten, dass die Einnahme von Tresteröl einer durch Mikroglia-Überaktivierung verursachten Neuroinflammation vorbeugen und so das Risiko der Entwicklung und des Fortschreitens der Alzheimer-Krankheit verringern könnte.

2. ARBEITSHYPOTHESE

   Dieses Projekt basiert auf dem Nachweis, dass TRL sowohl künstlichen als auch menschlichen Ursprungs in der Lage sind, die Aktivierung von Mikroglia auszulösen, einem Phänomen, das mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit verbunden ist. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass der Verzehr von Oliventresteröl und seinen bioaktiven Verbindungen diese Aktivierung abschwächen kann. Der Ansatz dieses Forschungsprojekts besteht darin, dass der Verzehr von Oliventresteröl bei Alzheimer-Patienten zur Bildung von postprandialen TRL führt, die diese bioaktiven Verbindungen aufrechterhalten und somit ihre Schutzkapazität gegen Mikroglia-Aktivierung und -Entzündung bewahren.

   Sollte dies der Fall sein, würden die gewonnenen Erkenntnisse den Grundstein für die Entwicklung neuer gesundheitlicher Anwendungen von Tresteröl legen, die auf dem Einfluss des in der postprandialen Phase gebildeten TRL basieren und zur Vorbeugung und Behandlung von Alzheimer eingesetzt werden könnten Krankheit.

3. ZIELE

Um die obige Hypothese zu testen, werden diese spezifischen Ziele angesprochen:

1. Bestimmung möglicher Veränderungen im postprandialen Lipidstoffwechsel bei Patienten mit leichter oder im Frühstadium diagnostizierter Alzheimer-Krankheit.
2. Es sollte beurteilt werden, ob die Einnahme von Tresteröl diese Veränderungen im postprandialen Lipidstoffwechsel im Vergleich zu Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt normalisieren kann.
3. Zur Gewinnung und Charakterisierung menschlicher TRL, die nach der Einnahme von Tresteröl oder Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt erhalten werden.
4. Es sollte die dämpfende Wirkung der Mikroglia-Aktivierung durch TRL nach Einnahme von Tresteröl im Vergleich zu Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt bewertet werden.

4. EXPERIMENTELLES DESIGN UND AKTIVITÄTEN

Die Studie ist als randomisierte, doppelblinde, postprandiale Crossover-Studie mit Alzheimer-Patienten konzipiert, die nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt und mit gesunden Kontrollpersonen gleichen Alters verglichen werden. Alle Probanden erhalten Tresteröl und ein Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt.

AKTIVITÄT 1. Gewinnung eines Tresteröls, das reich an bioaktiven Verbindungen ist

Das Oliventresteröl wird von ORIVA bereitgestellt, während das Sonnenblumenöl mit hohem Ölsäuregehalt kommerziellen Ursprungs sein wird. Beide Öle werden am Instituto de la Grasa-CSIC charakterisiert, um ihren Gehalt an Säuren und Triterpenalkoholen, Tocopherolen und Sterinen zu bestimmen.

AKTIVITÄT 2. AUSWAHL VON FREIWILLIGEN UND VERWALTUNG DER VERSUCHSÖLE

Unteraktivität 2.1. Auswahl der Freiwilligen

Der postprandiale Versuch wird gemäß den Grundprinzipien der Deklaration von Helsinki, der Konvention des Europarats und der Allgemeinen Erklärung der UNESCO durchgeführt und in der neurologischen Abteilung des Krankenhauses Virgen de Valme in Sevilla stattfinden. Erwachsene Freiwillige werden aus denjenigen ausgewählt, bei denen Alzheimer diagnostiziert wurde, basierend auf den Ergebnissen klinischer und kognitiver Tests unter Verwendung von Standardkriterien sowie unter Verwendung spezifischer Biomarker. Zu den Einschlusskriterien gehören auch ausreichende Seh- und Hörfähigkeiten sowie eine Nachverfolgung der Krankheitsentwicklung durch das Gesundheitspersonal. Zu den Ausschlusskriterien gehören klinisch signifikante psychiatrische Störungen; systemische Erkrankungen oder Infektionen, die die Sicherheit beeinträchtigen könnten; Herz-Kreislauf-Erkrankung innerhalb der letzten 2 Jahre; unkontrollierter Bluthochdruck innerhalb der letzten 6 Monate; Krebs innerhalb der letzten 5 Jahre; Drogen- oder Alkoholmissbrauch innerhalb der letzten 2 Jahre; und insulinabhängiger Diabetes.

Für die Teilnahme müssen Einzelpersonen außerdem eine schriftliche Zustimmung zu einem von der Ethikkommission des Krankenhauses Virgen de Valme genehmigten Protokoll geben, nachdem sie sowohl mündlich als auch schriftlich informiert wurden. Sie werden aufgefordert, am Tag vor der Durchführung der Versuche auf den Konsum von alkoholischen Getränken und Tabak zu verzichten.

Unteraktivität 2.2. Bestimmung der Stichprobengröße. Die in dieser Studie zu untersuchende quantitative Variable ist die postprandiale Plasmatriglyceridkonzentration. Unter der Annahme, dass die Triglyceridkonzentration durch die Aufnahme von Oliventresteröl im Vergleich zu High-Oleic-Sonnenblumenöl um mindestens 10 % reduziert wird und unter Berücksichtigung einer Studiensicherheit von 95 % (Risiko α 0,05; zα 1,645) und einer Trennschärfe von 90 % (zβ 1,282) ergibt sich eine Stichprobengröße von 16 Freiwilligen. Aufgrund möglicher Ablehnungen durch Freiwillige (obwohl keine nachteiligen Auswirkungen zu erwarten sind) wird es als ratsam erachtet, die Stichprobengröße auf 20 Probanden pro Gruppe zu erhöhen.

Unteraktivität 2.3. Verabreichung von Versuchsmahlzeiten Am Tag des Versuchs wird jedem Teilnehmer nach 12-stündigem Fasten über Nacht eine Blutprobe durch Punktion der Ellenvene entnommen. Anschließend erhalten sie eine Portion Trester-Olivenöl oder High-Oleic-Sonnenblumenöl, das sie als Teil eines Frühstücks mit Kaffee oder Milch und Toast mit Vollkornbrot zu sich nehmen. Nach der Einnahme werden jedem Teilnehmer über einen postprandialen Zeitraum von 7 Stunden stündlich Blutaliquots entnommen. Während dieser Zeit ist der freie Zugang zur Wasserentnahme gestattet.

AKTIVITÄT 3. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG MENSCHLICHER TRIGLYCERID-REICHER LIPOPROTEINE (TRL)

Unteraktivität 3.1. Bestimmungen im Blutserum Aus den gewonnenen Aliquots des Kubitalbluts wird Serum durch Zentrifugation gewonnen und NaN3, PMSF und Aprotinin als Konservierungsmittel zur Vermeidung eines proteolytischen Abbaus zugesetzt. Die Seren werden bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Im Blutserum wird die Triglyceridkonzentration durch Spektrophotometrie und die Apolipoprotein B-Konzentration durch Immunturbidimetrie bestimmt. Diese Messungen ermöglichen die Überwachung der Entwicklung der postprandialen TRL-Bildung und -Clearance. Darüber hinaus werden die Serumkonzentrationen von Oleanolsäure, Alpha-Tocopherol und Beta-Sitosterin bestimmt. Es folgt ein analytisches Extraktions- und Fraktionierungssystem, das die in unserem Labor entwickelte GC-MS-Methode zur Identifizierung und Quantifizierung des Triterpens verwendet.

Unteraktivität 3.2. Isolierung und Charakterisierung triglyceridreicher Lipoproteine ​​(TRL) Das Vorhandensein von Oleanolsäure in TRL, das durch Ultrazentrifugation von im postprandialen Test erhaltenen Seren isoliert wurde, wird untersucht. Der Fettsäure- und TG-Gehalt sowie Apo B48 und B100 als Marker für das Vorhandensein von Chylomikronen und VLDL werden durch ELISA bestimmt. Dieselben Partikel werden für die Mikroglia-Aktivierungsstudie (Aktivität 4) verwendet.

AKTIVITÄT 4. MIKROGLIAL-AKTIVIERUNG IN MENSCHLICHEN TRL-BEHANDELTEN BV-2-ZELLEN In dieser Aktivität wird die Mauszelllinie BV-2 als Mikroglia-Zellmodell verwendet. Dieser Zelltyp wird in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, Streptomycin (100 mg/ml) und Penicillin (100 IU/ml), bei 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 kultiviert. Die Experimente werden in 5 % FBS-reduziertem Medium durchgeführt. Die Zellen werden mit TRLs behandelt, die im postprandialen Assay erhalten wurden. Die Behandlungen werden 24 Stunden lang aufrechterhalten.

Unteraktivität 4.1. Einfluss von menschlichem TRL auf die Zelllebensfähigkeit Zunächst soll die Zelllebensfähigkeit mit der MTT-Methode (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) gemessen werden. Nach 24-stündiger Inkubation werden die Zellen mit frischem Medium, ergänzt mit 5 % FBS, gewaschen und 12, 24 und 36 Stunden mit TRL behandelt. Die Zellen werden mit frischem Medium, ergänzt mit 5 % FBS, gewaschen und 12, 24 und 36 Stunden lang mit TRL behandelt. Anschließend wird die MTT-Lösung zugegeben. Der resultierende Formazan-Niederschlag wird in DMSO gelöst und die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Messung der Absorption bei 490 nm quantifiziert.

Unteraktivität 4.2. Auswirkung auf die ROS-Produktion und Redoxaktivität Zur Bestimmung wird die fluoreszierende Sonde 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) verwendet, die durch die Zellmembran diffundiert und von intrazellulären Esterasen hydrolysiert wird, um nicht fluoreszierendes DCFH zu bilden intrazelluläre Konzentration von ROS. In Gegenwart von ROS wird DCFH schnell zu stark fluoreszierendem Dichlorfluorescein (DCF) oxidiert. Die Intensität der emittierten Fluoreszenz (Anregung bei 485 nm, Emission bei 825 nm) ist proportional zur intrazellulären Konzentration von ROS.

Gesamtglutathion sowie oxidiertes Glutathion werden mit der enzymatischen Methode bestimmt, die auf der NADPH-abhängigen GSSG-Reduktaseaktivität basiert und den aus GSH und Dithionitrobenzoesäure (DTNB) gebildeten Komplex spektrophotometrisch überwacht.

Unteraktivität 4.3. Wirkung menschlicher TRLs auf die Zytokinproduktion BV-2-Zellen werden mit postprandialen TRLs behandelt und die Produktion entzündungsfördernder und entzündungshemmender Zytokine im Kulturüberstand wird mithilfe kommerzieller ELISA-Kits gemäß den Protokollen des Herstellers bestimmt.

Unteraktivität 4.4. Wirkung menschlicher TRLs auf die Zytokin-Genexpression BV-2-Zellen werden mit postprandialen TRLs behandelt und mRNA wird isoliert. Um die Genexpression der interessierenden Zytokine zu bestimmen, wird die Echtzeit-PCR-Technik nach Retrotranskription in cDNA verwendet, wobei für diesen Zweck entwickelte Primer verwendet werden.