Dæmpning af postprandiale inflammatoriske processer hos patienter med Alzheimers sygdom ved indtagelse af olie af presserester (CORDIAL)

1. BAGGRUND

   Alzheimers sygdom (AD) er den mest almindelige årsag til demens, og dens udbredelse forventes at blive firdoblet i 2050. Alzheimers er patologisk karakteriseret ved betydeligt neuronalt tab og kronisk inflammation, som er forbundet med cerebrovaskulær og parenkymal akkumulering af proteinaflejringer beriget med amyloid-beta (Aβ) og hyperphosphoryleret Tau-protein. Akkumulerende beviser tyder på, at forstyrrelse af blod-hjerne-barrierefunktionen, som adskiller centralnervesystemet fra det perifere kredsløb, kan øge risikoen for debut og forværre forløbet af AD.

   Microglia er blevet foreslået at spille en afgørende rolle i de fleste neuropatologier, da de aktiveres ved påvisning af ændringer i hjernens homeostase. Denne celletype fungerer som fastboende makrofager i hjernen, der konstant scanner det lokale mikromiljø for tegn på infektion og skade og bliver aktiveret, når det bliver fundet. Som et resultat frigives et væld af pro-inflammatoriske mediatorer, herunder cytokiner, reaktive oxygenarter (ROS) og nitrogenoxid. I modsætning hertil er antioxidantforsvarssystemer, såsom glutathionperoxidase-1 og superoxiddismutase-1, nedsat hos AD-patienter.

   En betydelig del af plasma Aβ er forbundet med triglyceridrige lipoproteiner (TRL), der udskilles fra hepatocytter og enterocytter. Disse partikler er karakteriseret ved apolipoprotein B, som tjener som en indikator for postprandial dyslipidæmi, som er en overdreven, men forbigående stigning i TRL efter fedtoptagelse i kosten og fører til dannelsen af ​​åreforkalkning. Dette fænomen kan være forbindelsen mellem hjertekarsygdomme og Alzheimers sygdom. Eksistensen af ​​en sådan forbindelse er allerede blevet påvist i kliniske og tværsnitsundersøgelser, men den underliggende mekanisme er stadig uklar.

   Der er akkumulerende beviser for, at fedtindtag i kosten er forbundet med opståen og progression af Alzheimers sygdom. Indtagelse af mættet fedtsyre (SFA) ville således være en skadelig faktor, der fremmer dyslipidæmi, endothelial dysfunktion, inflammation og oxidativt stress. I modsætning hertil er forbrug af fedtstoffer rigt på poly- eller monoumættede fedtsyrer (PUFA og MUFA) forbundet med lavere sygdomsprævalens, sandsynligvis som følge af lavere niveauer af systemisk inflammation.

   Olivenpresserolie udvindes af det faste biprodukt fra olivenolieproduktion ved opløsningsmiddelekstraktion eller centrifugering. Opbevaringsperioden for dette biprodukt muliggør berigelse af olien med komponenterne af frugtskræl og træblade, af stor interesse på grund af deres biologiske aktivitet, som kun findes i spor i jomfruolivenolie. Centrifugeret olie af olivenpresserester er således beriget med komponenter af den uforsæbelige fraktion, som er fedtopløselige. Selvom en del af disse forbindelser går tabt under raffinering, kan de under milde raffineringsbetingelser tilbageholdes i relevante koncentrationer. Disse komponenter omfatter steroler og tocopheroler samt triterpensyrerne oleanolisk og maslinsyre.

   I tidligere in vitro-undersøgelser har efterforskerne vist, at de bioaktive forbindelser i olivenpresseresterolie alfa-tocopherol, oleanolsyre og beta-sitosterol var i stand til at svække mikroglial aktivering, både isoleret og som en del af kunstige triglycerid-rige lipoproteiner (TRL). Mikroglial dæmpning blev bestemt ved at måle forskellige markører for inflammation og oxidativt stress, som frigives af cellen, når de udsættes for stimulering, der fører til overaktivering. Denne opdagelse åbnede døren til muligheden for, at hvis disse bioaktive forbindelser når hjernen, kan de hjælpe med at forhindre eller bremse udviklingen af ​​neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom.

   Efterforskerne udførte derefter en sammenlignende postprandial undersøgelse for at bestemme, om human TRL opnået efter indtagelse af olivenpresseresterolie var i stand til at dæmpe mikroglial aktivering i højere grad end dem opnået efter indtagelse af solsikkeolie med højt olieindhold. Efterforskerne fandt ud af, at på visse tidspunkter i den postprandiale periode var frigivelsen af ​​markører for inflammation og oxidativt stress fra mikrogliaceller behandlet med TRL lavere, når de var afledt af olieindtag af olivenpresserester. Det blev således påvist, at hos raske forsøgspersoner resulterer indtagelse af presserester i den postprandiale periode i produktionen af ​​lipoproteiner, der bærer dets bioaktive forbindelser, og at disse deltager i dæmpningen af ​​mikroglial aktivering.

   Derfor mener efterforskerne, at tiden er inde til at teste vores hypotese hos patienter diagnosticeret med Alzheimers sygdom, som har hukommelsesproblemer eller begyndende kognitiv svækkelse. For dette projekt antager efterforskerne, at disse patienter vil have ændringer i postprandial lipidmetabolisme, som vil resultere i TRL med en større kapacitet til at overaktivere mikroglia, men at indtagelsen af ​​presserester vil dæmpe denne aktivering. Hvis dette er tilfældet, tyder det på, at indtagelsen af ​​presserester kan forhindre neuroinflammation forårsaget af mikroglia-overaktivering, hvilket reducerer risikoen for at udvikle og udvikle Alzheimers sygdom.

2. ARBEJDSHYPOTESE

   Dette projekt er baseret på demonstrationen af, at TRL, både kunstig og af menneskelig oprindelse, er i stand til at fremkalde aktivering af mikroglia, et fænomen forbundet med neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom. Derudover har forbruget af olivenpresseolie og dets bioaktive forbindelser vist sig at kunne dæmpe denne aktivering. Tilgangen til dette forskningsprojekt er, at Alzheimers patienters indtagelse af olivenpresserester vil føre til dannelsen af ​​postprandiale TRL, der opretholder disse bioaktive forbindelser og dermed bevarer deres beskyttende kapacitet mod mikroglial aktivering og inflammation.

   Hvis dette er tilfældet, vil den opnåede evidens lægge grundlaget for udviklingen af ​​nye sundhedsanvendelser af presseresterolie, som vil være baseret på indflydelsen af ​​TRL dannet i den postprandiale periode, og som kan bruges til forebyggelse og behandling af Alzheimers sygdom.

3. MÅL

For at teste ovenstående hypotese vil disse specifikke mål blive behandlet:

1. At bestemme mulige ændringer i postprandial lipidmetabolisme hos patienter med mild eller tidlig diagnosticeret Alzheimers sygdom.
2. At vurdere om indtaget af presserester er i stand til at normalisere disse ændringer i postprandial lipidmetabolisme sammenlignet med solsikkeolie med højt olieindhold.
3. At opnå og karakterisere human TRL opnået efter indtagelse af presserester eller solsikkeolie med højt olieindhold.
4. For at evaluere den dæmpende effekt af mikroglial aktivering af TRL opnået efter indtagelse af presseresterolie sammenlignet med solsikkeolie med højt olieindhold.

4. EKSPERIMENTELT DESIGN OG AKTIVITETER

Studiet er designet som et randomiseret, dobbeltblindt, postprandialt crossover-forsøg med Alzheimers-patienter, som vil blive opdelt tilfældigt i to grupper og vil blive sammenlignet med raske kontroller på samme alder. Alle forsøgspersoner vil modtage presseresterolie og en solsikkeolie med højt olieindhold.

AKTIVITET 1. OPNÅELSE AF EN PLASTOLIE RIG PÅ BIOAKTIVE FORBINDELSER

Olivenpresserolie vil blive leveret af ORIVA, mens solsikkeolie med højt olieindhold vil være af kommerciel oprindelse. Begge olier vil blive karakteriseret ved Instituto de la Grasa-CSIC for at bestemme deres indhold i sure og triterpeniske alkoholer, tocopheroler og steroler.

AKTIVITET 2. UDVÆLGELSE AF FRIVILLIGE OG ADMINISTRATION AF DE EKSPERIMENTELLE OLIER

Delaktivitet 2.1. Udvælgelse af frivillige

Det postprandiale forsøg vil blive udført i overensstemmelse med de grundlæggende principper i Helsinki-erklæringen, Europarådets konvention og UNESCO's verdenserklæring og vil finde sted på den neurologiske afdeling på Hospital Virgen de Valme i Sevilla. Voksne frivillige vil blive udvalgt blandt dem, der er blevet diagnosticeret med Alzheimers sygdom, baseret på resultaterne af kliniske og kognitive tests ved brug af standardkriterier samt med brug af specifikke biomarkører. Inklusionskriterier vil også omfatte tilstrækkelige syns- og høreevner og at have en opfølgningsregistrering af sygdommens udvikling af sundhedspersonale. Eksklusionskriterier vil omfatte klinisk signifikante psykiatriske lidelser; systemisk sygdom eller infektion, der kan påvirke sikkerheden; kardiovaskulær sygdom inden for de sidste 2 år; ukontrolleret hypertension inden for de sidste 6 måneder; kræft inden for de sidste 5 år; stof- eller alkoholmisbrug inden for de sidste 2 år; og insulinafhængig diabetes.

For deltagelse er enkeltpersoner også forpligtet til at give skriftligt samtykke til en protokol godkendt af den etiske komité på Virgen de Valme Hospital, efter at være blevet informeret både mundtligt og skriftligt. De vil blive opfordret til at undgå indtagelse af alkoholholdige drikkevarer og tobak i løbet af dagen forud for udførelsen af ​​retssagen.

Delaktivitet 2.2. Bestemmelse af prøvestørrelse. Den kvantitative variabel, der skal undersøges i denne undersøgelse, er den postprandiale plasmatriglyceridkoncentration. Det antages, at triglyceridkoncentrationen vil blive reduceret med mindst 10 % som følge af indtagelse af olivenpresseresterolie sammenlignet med solsikkeolie med højt olieindhold og i betragtning af en undersøgelsessikkerhed på 95 % (risiko α 0,05; zα 1,645) og en styrke på 90 % (zβ 1,282), opnås en prøvestørrelse på 16 frivillige. På grund af mulige frivillige afslag (selvom der ikke forventes nogen bivirkninger), anses det for fornuftigt at øge prøvestørrelsen til 20 forsøgspersoner pr. gruppe.

Delaktivitet 2.3. Administration af eksperimentelle måltider På forsøgsdagen og efter 12 timers faste natten over vil hver deltager få taget en blodprøve ved punktering af venen cubital. De vil derefter modtage en dosis af presserester olivenolie eller solsikkeolie med højt olieindhold, som de vil spise som en del af en morgenmad med kaffe eller mælk og toast med fuldkornsbrød. Efter indtagelse vil hver deltager få udtaget blodprøver hver time i en postprandial periode på 7 timer. I dette tidsrum vil der være fri adgang til vandindtag.

AKTIVITET 3. ISOLERING OG KARAKTERISERING AF HUMAN TRIGLYCERID-RIKE LIPOPROTEINER (TRL)

Delaktivitet 3.1. Bestemmelser i blodserum Ud fra de opnåede alikvoter af cubitalblod skal serum opnås ved centrifugering, og NaN3, PMSF og aprotinin tilsættes som konserveringsmidler for at undgå proteolytisk nedbrydning. Seraene vil blive opbevaret ved -80 °C indtil analyse. I blodserum vil triglyceridkoncentrationen blive bestemt ved spektrofotometri og apolipoprotein B-koncentrationen ved immunoturbidimetri. Disse målinger vil muliggøre overvågning af udviklingen af ​​postprandial TRL-dannelse og clearance. Derudover vil serumkoncentrationer af oleanolsyre, alfa-tocopherol og beta-sitosterol blive bestemt. Et analytisk ekstraktions- og fraktioneringssystem vil blive fulgt ved brug af GC-MS-metoden udviklet i vores laboratorium til identifikation-kvantificering af triterpen.

Delaktivitet 3.2. Isolering og karakterisering af triglyceridrige lipoproteiner (TRL) Tilstedeværelsen af ​​oleanolsyre i TRL isoleret ved ultracentrifugering af sera opnået i det postprandiale assay vil blive undersøgt. Fedtsyre- og TG-indhold og apo B48 og B100, som markører for tilstedeværelsen af ​​chylomikroner og VLDL, vil blive bestemt ved ELISA. De samme partikler vil blive brugt til mikroglial aktiveringsundersøgelsen (Aktivitet 4).

AKTIVITET 4. MIKROGLIAL AKTIVERING I HUMAN TRL-BEHANDLEDE BV-2-CELLER I denne aktivitet vil musecellelinjen BV-2 blive brugt som en mikrogliacellemodel. Denne celletype vil blive dyrket i DMEM-medium suppleret med 10 % varmeinaktiveret FBS, streptomycin (100 mg/ml) og penicillin (100 IE/ml), under 100 % fugtighed og 5 % CO2. Eksperimenter vil blive udført i 5% FBS reduceret medium. Celler vil blive behandlet med TRL'er opnået i det postprandiale assay. Behandlinger vil blive opretholdt i 24 timer.

Delaktivitet 4.1. Virkning af human TRL på cellelevedygtighed Først skal cellelevedygtighed måles ved hjælp af MTT-metoden (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium). Efter inkubation i 24 timer skal cellerne vaskes med frisk medium suppleret med 5 % FBS og behandles med TRL i 12, 24 og 36 timer. Cellerne skal vaskes med frisk medium suppleret med 5 % FBS og behandles med TRL i 12, 24 og 36 timer. MTT-opløsningen skal derefter tilsættes. Det resulterende formazan-præcipitat vil blive opløst i DMSO, og cellelevedygtighed vil blive kvantificeret ved at måle absorbans ved 490 nm.

Delaktivitet 4.2. Effekt på ROS-produktion og redoxaktivitet Den fluorescerende probe 2',7'-dichlorfluorescein-diacetat (DCFH-DA), som diffunderer over cellemembranen og hydrolyseres af intracellulære esteraser til dannelse af ikke-fluorescerende DCFH, vil blive brugt til at bestemme intracellulær koncentration af ROS. I nærvær af ROS oxideres DCFH hurtigt til dannelse af højfluorescerende dichlorfluorescein (DCF). Intensiteten af ​​den udsendte fluorescens (485 nm excitation, 825 nm emission) er proportional med den intracellulære koncentration af ROS.

Total glutathion såvel som oxideret glutathion vil blive bestemt ved den enzymatiske metode, baseret på den NADPH-afhængige GSSG-reduktaseaktivitet, som spektrofotometrisk overvåger komplekset dannet af GSH og dithionitrobenzoesyre (DTNB).

Delaktivitet 4.3. Effekt af humane TRL'er på cytokinproduktion BV-2-celler vil blive behandlet med postprandiale TRL'er, og produktionen af ​​pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske cytokiner i kultursupernatanten vil blive bestemt ved hjælp af kommercielle ELISA-kits i henhold til producentens protokoller.

Delaktivitet 4.4. Effekt af humane TRL'er på cytokin-genekspression BV-2-celler vil blive behandlet med postprandiale TRL'er, og mRNA vil blive isoleret. For at bestemme genekspressionen af ​​cytokinerne af interesse, vil real-time PCR-teknikken efter retrotranskription til cDNA blive anvendt ved anvendelse af primere designet til dette formål.