Aterian jälkeisten tulehdusprosessien vaimentaminen Alzheimerin tautia sairastavilla potilailla puristemassaöljyn kulutuksella (CORDIAL)

1. TAUSTA

   Alzheimerin tauti (AD) on yleisin dementian syy, ja sen esiintyvyyden odotetaan nelinkertaistuvan vuoteen 2050 mennessä. Alzheimerin taudille on patologisesti tunnusomaista huomattava hermosolujen menetys ja krooninen tulehdus, joka liittyy amyloidi-beetalla (Aβ) ja hyperfosforyloidulla Tau-proteiinilla rikastettujen proteiinikertymien kertymiseen aivoverenkiertoon ja parenkyymiin. Kertyvä näyttö viittaa siihen, että veri-aivoesteen toiminnan häiriintyminen, joka erottaa keskushermoston perifeerisestä verenkierrosta, voi lisätä AD:n puhkeamisriskiä ja pahentaa sen etenemistä.

   Microglialla on ehdotettu olevan ratkaiseva rooli useimmissa neuropatologioissa, koska ne aktivoituvat havaitessaan muutoksia aivojen homeostaasissa. Tämä solutyyppi toimii kuin aivoissa asuvat makrofagit, jotka skannaavat jatkuvasti paikallista mikroympäristöä infektioiden ja vammojen varalta ja aktivoituvat, kun niitä löydetään. Tämän seurauksena vapautuu joukko tulehdusta edistäviä välittäjiä, mukaan lukien sytokiinit, reaktiiviset happilajit (ROS) ja typpioksidi. Sitä vastoin antioksidanttipuolustusjärjestelmät, kuten glutationiperoksidaasi-1 ja superoksididismutaasi-1, ovat vähentyneet AD-potilailla.

   Merkittävä osa plasman Aβ:sta liittyy triglyseridirikkaisiin lipoproteiineihin (TRL), jotka erittyvät maksasoluista ja enterosyyteistä. Näille hiukkasille on tunnusomaista apolipoproteiini B, joka toimii aterian jälkeisen dyslipidemian indikaattorina, mikä on liioiteltua mutta ohimenevää TRL:n nousua ravinnon rasvan imeytymisen jälkeen ja johtaa ateroskleroosin muodostumiseen. Tämä ilmiö saattaa olla yhteys sydän- ja verisuonitautien ja Alzheimerin taudin välillä. Tällaisen yhteyden olemassaolo on jo osoitettu kliinisissä ja poikkileikkaustutkimuksissa, mutta taustalla oleva mekanismi on edelleen epäselvä.

   On jatkuvasti todisteita siitä, että ravinnon rasvan saanti liittyy Alzheimerin taudin puhkeamiseen ja etenemiseen. Siten tyydyttyneiden rasvahappojen (SFA) saanti olisi haitallinen tekijä, joka edistää dyslipidemiaa, endoteelin toimintahäiriötä, tulehdusta ja oksidatiivista stressiä. Sitä vastoin moni- tai kertatyydyttymättömiä rasvahappoja sisältävien rasvojen (PUFA ja MUFA) nauttiminen liittyy alhaisempaan tautien esiintyvyyteen, mikä johtuu luultavasti systeemisen tulehduksen alhaisemmista tasoista.

   Oliivin puristemassaöljyä saadaan oliiviöljyntuotannon kiinteästä sivutuotteesta liuotinuutolla tai sentrifugoimalla. Tämän sivutuotteen varastointiaika mahdollistaa öljyn rikastamisen hedelmänkuoren ja puiden lehtien ainesosilla, jotka ovat erittäin mielenkiintoisia niiden biologisen aktiivisuuden vuoksi, joita on vain jäämiä neitsytoliiviöljystä. Siten sentrifugoitu oliivin puristemassaöljy on rikastettu saippuoitumattoman jakeen aineosilla, jotka ovat rasvaliukoisia. Vaikka osa näistä yhdisteistä häviää raffinoinnin aikana, miedoissa raffinointiolosuhteissa niitä voidaan säilyttää relevanteissa pitoisuuksissa. Näitä komponentteja ovat sterolit ja tokoferolit sekä triterpeenihapot oleanoli- ja masliinihappo.

   Aiemmissa in vitro -tutkimuksissa tutkijat osoittivat, että oliivin puristemassaöljyn alfa-tokoferolin, oleanolihapon ja beeta-sitosterolin bioaktiiviset yhdisteet pystyivät heikentämään mikrogliaaktivaatiota sekä yksinään että osana keinotekoisia triglyseridirikkaita lipoproteiineja (TRL). Mikroglian vaimennus määritettiin mittaamalla erilaisia ​​tulehduksen ja oksidatiivisen stressin markkereita, joita solu vapauttaa, kun ne altistetaan stimulaatiolle, joka johtaa yliaktivoitumiseen. Tämä havainto avasi oven mahdollisuudelle, että jos nämä bioaktiiviset yhdisteet pääsevät aivoihin, ne voivat auttaa ehkäisemään tai hidastamaan hermostoa rappeuttavien sairauksien, kuten Alzheimerin taudin, kehittymistä.

   Tämän jälkeen tutkijat suorittivat vertailevan aterian jälkeisen tutkimuksen selvittääkseen, pystyivätkö oliivin puristemassaöljyn nauttimisen jälkeen saadut ihmisen TRL:t heikentämään mikrogliaaktivaatiota enemmän kuin ne, jotka saatiin runsaan oleiinipitoisen auringonkukkaöljyn nauttimisen jälkeen. Tutkijat havaitsivat, että tiettyinä aikoina aterian jälkeisenä aikana TRL:llä käsiteltyjen mikrogliasolujen tulehduksen ja oksidatiivisen stressin merkkiaineiden vapautuminen oli vähäisempää, kun ne olivat peräisin oliivin puristemassaöljyn nauttimisesta. Siten osoitettiin, että terveillä koehenkilöillä puristemassaöljyn nauttiminen aterian jälkeisenä aikana johtaa lipoproteiinien tuotantoon, jotka kantavat sen bioaktiivisia yhdisteitä ja että nämä osallistuvat mikrogliaaktivaation vaimenemiseen.

   Näin ollen tutkijat uskovat, että on tullut aika testata hypoteesiamme potilailla, joilla on diagnosoitu Alzheimerin tauti ja joilla on muistiongelmia tai alkavaa kognitiivista heikkenemistä. Tässä projektissa tutkijat olettavat, että näillä potilailla on muutoksia aterian jälkeisessä lipidimetaboliassa, mikä johtaa TRL:ään, jolla on suurempi kyky yliaktivoida mikrogliaa, mutta puristemassaöljyn nauttiminen heikentää tätä aktivaatiota. Jos näin on, se viittaa siihen, että puristemassaöljyn nauttiminen voi estää mikroglian yliaktivoitumisen aiheuttaman hermoston tulehduksen, mikä vähentää Alzheimerin taudin kehittymisen ja etenemisen riskiä.

2. TYÖHYPOTEESI

   Tämä projekti perustuu osoitukseen siitä, että TRL, sekä keinotekoinen että ihmisperäinen, kykenee aktivoimaan mikroglian, ilmiön, joka liittyy hermostoa rappeutuviin sairauksiin, kuten Alzheimerin tautiin. Lisäksi oliivin puristemassaöljyn ja sen bioaktiivisten yhdisteiden kulutuksen on osoitettu voivan vaimentaa tätä aktivaatiota. Tämän tutkimusprojektin lähestymistapa on, että Alzheimerin tautia sairastavien potilaiden oliivin puristemassaöljyn kulutus johtaa aterian jälkeisten TRL-solujen muodostumiseen, jotka ylläpitävät näitä bioaktiivisia yhdisteitä ja säilyttävät siten suojakykynsä mikrogliaaktivaatiota ja tulehdusta vastaan.

   Jos näin on, saadut todisteet loisivat pohjan puristemassaöljyn uusien terveyssovellusten kehittämiselle, jotka perustuisivat aterian jälkeisenä aikana muodostuneen TRL:n vaikutukseen ja joita voitaisiin käyttää Alzheimerin taudin ehkäisyyn ja hoitoon. sairaus.

3. TAVOITTEET

Yllä olevan hypoteesin testaamiseksi käsitellään näitä erityistavoitteita:

1. Selvittää mahdollisia muutoksia aterian jälkeisessä lipidimetaboliassa potilailla, joilla on lievä tai varhaisessa vaiheessa diagnosoitu Alzheimerin tauti.
2. Arvioida, pystyykö puristemassaöljyn nauttiminen normalisoimaan nämä muutokset aterian jälkeisessä lipidimetaboliassa verrattuna runsaasti oleiinihappoa sisältävään auringonkukkaöljyyn.
3. Saada ja karakterisoida ihmisen TRL, joka on saatu puristemassaöljyn tai runsaasti oleiinia sisältävän auringonkukkaöljyn nauttimisen jälkeen.
4. Arvioida puristemassaöljyn nauttimisen jälkeen saadun TRL:n mikrogliaaktivaation heikentävä vaikutus verrattuna runsaasti oleiinihappoa sisältävään auringonkukkaöljyyn.

4. KOKEELLINEN SUUNNITTELU JA TOIMINTA

Tutkimus on suunniteltu satunnaistetuksi, kaksoissokkoutetuksi aterian jälkeiseksi crossover-tutkimukseksi Alzheimerin tautia sairastavilla potilailla, jotka jaetaan satunnaisesti kahteen ryhmään ja verrataan samanikäisiin terveisiin kontrolleihin. Kaikki tutkittavat saavat puristemassaöljyä ja runsaasti oleiinia sisältävää auringonkukkaöljyä.

AKTIIVISUUS 1. BIIOAKTIIVISIA YHDISTEITÄ RIKASTAAN TUOTTEEN ÖLJYN SAAMINEN

Oliivin puristemassaöljyn toimittaa ORIVA, kun taas öljypitoinen auringonkukkaöljy on kaupallista alkuperää. Molemmat öljyt karakterisoidaan Instituto de la Grasa-CSIC:ssä niiden happamien ja triterpeenialkoholien, tokoferolien ja sterolien pitoisuuden määrittämiseksi.

TOIMINTA 2. VAPAAEHTOISTEN VALINTA JA KOEÖLJYJEN HALLINTA

Alatoiminto 2.1. Vapaaehtoisten valinta

Aterian jälkeinen koe suoritetaan Helsingin julistuksen, Euroopan neuvoston yleissopimuksen ja Unescon yleismaailmallisen julistuksen perusperiaatteita noudattaen ja se tapahtuu Virgen de Valmen sairaalan neurologisella osastolla Sevillassa. Aikuiset vapaaehtoiset valitaan niistä, joilla on diagnosoitu Alzheimerin tauti kliinisten ja kognitiivisten testien tulosten perusteella standardikriteereillä sekä spesifisiä biomarkkereita käyttäen. Osallistumiskriteereinä ovat myös riittävät näkö- ja kuulokyvyt sekä se, että terveydenhuoltohenkilöstö on seurannut sairauden kehittymistä. Poissulkemiskriteerit sisältävät kliinisesti merkittävät psykiatriset häiriöt; systeeminen sairaus tai infektio, joka voi vaikuttaa turvallisuuteen; sydän- ja verisuonitauti viimeisen 2 vuoden aikana; hallitsematon verenpainetauti viimeisen 6 kuukauden aikana; syöpä viimeisen 5 vuoden aikana; huumeiden tai alkoholin väärinkäyttö viimeisen 2 vuoden aikana; ja insuliinista riippuvainen diabetes.

Osallistuakseen henkilöiden tulee antaa kirjallinen suostumus Virgen de Valmen sairaalan eettisen toimikunnan hyväksymään protokollaan, saatuaan tiedon sekä suullisesti että kirjallisesti. Heitä kannustetaan välttämään alkoholijuomien ja tupakan käyttöä kokeiden suorittamista edeltävänä päivänä.

Alatoiminto 2.2. Näytteen koon määrittäminen. Tässä tutkimuksessa tutkittava kvantitatiivinen muuttuja on aterian jälkeinen plasman triglyseridipitoisuus. Olettaen, että triglyseridipitoisuus pienenee vähintään 10 % oliivin puristemassaöljyn nauttimisen seurauksena verrattuna runsaasti oleiinihappoa sisältävään auringonkukkaöljyyn ja kun otetaan huomioon tutkimuksen turvallisuus 95 % (riski α 0,05; zα 1,645) ja teho 90 % (zp 1,282), saadaan 16 vapaaehtoisen otoskoko. Mahdollisten vapaaehtoisten kieltäytymisen vuoksi (vaikka haittavaikutuksia ei ole odotettavissa), otoskokoa pidetään järkevänä kasvattaa 20 koehenkilöön ryhmää kohden.

Alatoiminto 2.3. Kokeellisten aterioiden antaminen Kokeilupäivänä ja 12 tunnin yön yli paaston jälkeen jokaiselta osallistujalta otetaan verinäyte kyynärlaskimopunktiolla. Sen jälkeen he saavat annoksen puristemassaa oliiviöljyä tai runsaasti oleiinihappoa sisältävää auringonkukkaöljyä, jonka he syövät osana aamiaista, joka sisältää kahvia tai maitoa ja paahtoleipää täysjyväleivän kera. Nielemisen jälkeen jokaiselle osallistujalle otetaan verinäytteet tunnin välein 7 tunnin ajan aterian jälkeen. Tänä aikana vesi on vapaasti käytettävissä.

TOIMINTA 3. IHMISEN TRIGLYSERIDIRIKKOJEN LIPOPROTEIINIEN (TRL) ERISTYS JA KARAKTERISointi

Alatoiminto 3.1. Veriseerumin määritykset Saatuista kuutioverimääristä on otettava seerumi sentrifugoimalla ja NaN3, PMSF ja aprotiniini lisätään säilöntäaineiksi proteolyyttisen hajoamisen välttämiseksi. Seerumit säilytetään -80 °C:ssa analyysiin asti. Veriseerumin triglyseridipitoisuus määritetään spektrofotometrialla ja apolipoproteiini B -pitoisuus immunoturbidimetrialla. Nämä mittaukset mahdollistavat aterian jälkeisen TRL:n muodostumisen ja puhdistuman kehityksen seurannan. Lisäksi määritetään oleanolihapon, alfa-tokoferolin ja beeta-sitosterolin pitoisuudet seerumissa. Noudatetaan analyyttistä uutto- ja fraktiointijärjestelmää käyttäen laboratoriossamme kehitettyä GC-MS-menetelmää triterpeenin tunnistamiseen ja kvantifiointiin.

Alatoiminto 3.2. Triglyseridirikkaiden lipoproteiinien (TRL) eristäminen ja karakterisointi Oleanolihapon läsnäoloa aterian jälkeisessä määrityksessä saatujen seerumien ultrasentrifugoinnilla eristetyssä TRL:ssä tutkitaan. Rasvahappo- ja TG-pitoisuus sekä apo B48 ja B100 kylomikronien ja VLDL:n esiintymisen markkereina määritetään ELISA:lla. Näitä samoja hiukkasia käytetään mikrogliaaktivaatiotutkimuksessa (aktiivisuus 4).

AKTIIVISUUS 4. MIKROGLIAAKTIVOINTI IHMISEN TRL-KÄSITTELYISSÄ BV-2-SOLUISSA Tässä toiminnassa hiiren BV-2-solulinjaa käytetään mikrogliasolumallina. Tätä solutyyppiä viljellään DMEM-elatusaineessa, jota on täydennetty 10 % lämpöinaktivoidulla FBS:llä, streptomysiinillä (100 mg/ml) ja penisilliinillä (100 IU/ml), 100 % kosteudessa ja 5 % C02:ssa. Kokeet suoritetaan 5 % FBS:llä pelkistetyssä alustassa. Solut käsitellään aterian jälkeisessä määrityksessä saaduilla TRL-arvoilla. Hoidot jatkuvat 24 tuntia.

Alatoiminto 4.1. Ihmisen TRL:n vaikutus solujen elinkelpoisuuteen Ensinnäkin solujen elinkelpoisuus on mitattava MTT-menetelmällä (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsolium). 24 tunnin inkubaation jälkeen solut pestään tuoreella alustalla, johon on lisätty 5 % FBS:ää, ja niitä käsitellään TRL:llä 12, 24 ja 36 tunnin ajan. Solut pestään tuoreella alustalla, johon on lisätty 5 % FBS:ää, ja niitä käsitellään TRL:llä 12, 24 ja 36 tunnin ajan. MTT-liuos lisätään sitten. Tuloksena saatu formatsaanisakka liuotetaan DMSO:hon ja solujen elinkelpoisuus kvantifioidaan mittaamalla absorbanssi 490 nm:ssä.

Alatoiminto 4.2. Vaikutus ROS-tuotantoon ja redox-aktiivisuuteen Fluoresoivaa koetinta 2',7'-dikloorifluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA), joka diffundoituu solukalvon läpi ja jota solunsisäiset esteraasit hydrolysoivat muodostaen ei-fluoresoivaa DCFH:ta, käytetään määritettäessä. solunsisäinen ROS-pitoisuus. ROS:n läsnä ollessa DCFH hapettuu nopeasti muodostaen erittäin fluoresoivaa dikloorifluoreseiinia (DCF). Emitoituneen fluoresenssin intensiteetti (485 nm viritys, 825 nm emissio) on verrannollinen ROS:n solunsisäiseen pitoisuuteen.

Kokonaisglutationi sekä hapettunut glutationi määritetään entsymaattisella menetelmällä, joka perustuu NADPH-riippuvaiseen GSSG-reduktaasiaktiivisuuteen, joka tarkkailee spektrofotometrisesti GSH:n ja ditionitrobentsoehapon (DTNB) muodostamaa kompleksia.

Alatoiminto 4.3. Ihmisen TRL:ien vaikutus sytokiinien tuotantoon BV-2-soluja käsitellään aterian jälkeisillä TRL-soluilla ja tulehdusta edistävien ja anti-inflammatoristen sytokiinien tuotanto viljelmän supernatantissa määritetään käyttämällä kaupallisia ELISA-pakkauksia valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Alatoiminto 4.4. Ihmisen TRL:ien vaikutus sytokiinigeenin ilmentymiseen BV-2-soluja käsitellään aterian jälkeisillä TRL:illä ja mRNA eristetään. Kiinnostuksen kohteena olevien sytokiinien geeniekspression määrittämiseksi käytetään reaaliaikaista PCR-tekniikkaa retrotranskription jälkeen cDNA:ksi käyttäen tähän tarkoitukseen suunniteltuja alukkeita.