Atenuación de los procesos inflamatorios posprandiales en pacientes con enfermedad de Alzheimer mediante el consumo de aceite de orujo (CORDIAL)

1. FONDO

   La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia y se espera que su prevalencia se cuadruplique para 2050. El Alzheimer se caracteriza patológicamente por una pérdida neuronal sustancial y una inflamación crónica, que se asocia con la acumulación cerebrovascular y parenquimatosa de depósitos de proteínas enriquecidos en beta-amiloide (Aβ) y proteína Tau hiperfosforilada. La evidencia acumulada sugiere que la alteración de la función de la barrera hematoencefálica, que separa el sistema nervioso central de la circulación periférica, puede aumentar el riesgo de aparición y empeorar el curso de la EA.

   Se ha propuesto que las microglías desempeñan un papel crucial en la mayoría de las neuropatologías, ya que se activan al detectar alteraciones en la homeostasis cerebral. Este tipo de células actúa como macrófagos residentes en el cerebro, escaneando constantemente el microambiente local en busca de signos de infección y lesión y activándose cuando los encuentra. Como resultado, se libera una gran cantidad de mediadores proinflamatorios, incluidas citocinas, especies reactivas de oxígeno (ROS) y óxido nítrico. Por el contrario, los sistemas de defensa antioxidantes, como la glutatión peroxidasa-1 y la superóxido dismutasa-1, están disminuidos en los pacientes con EA.

   Una parte importante del Aβ plasmático está asociada con lipoproteínas ricas en triglicéridos (TRL) que se secretan por hepatocitos y enterocitos. Estas partículas se caracterizan por la apolipoproteína B, que sirve como indicador de dislipidemia posprandial, que es un aumento exagerado pero transitorio del TRL después de la absorción de grasas de la dieta y conduce a la formación de aterosclerosis. Este fenómeno podría ser el vínculo entre las enfermedades cardiovasculares y la enfermedad de Alzheimer. La existencia de tal vínculo ya se ha demostrado en estudios clínicos y transversales, pero el mecanismo subyacente aún no está claro.

   Cada vez hay más pruebas de que la ingesta de grasas en la dieta está asociada con la aparición y progresión de la enfermedad de Alzheimer. Por tanto, la ingesta de ácidos grasos saturados (AGS) sería un factor nocivo, favoreciendo la dislipidemia, la disfunción endotelial, la inflamación y el estrés oxidativo. Por el contrario, el consumo de grasas ricas en ácidos grasos poliinsaturados o monoinsaturados (PUFA y MUFA) se asocia con una menor prevalencia de la enfermedad, probablemente como consecuencia de niveles más bajos de inflamación sistémica.

   El aceite de orujo de oliva se obtiene del subproducto sólido de la producción de aceite de oliva mediante extracción con disolventes o centrifugación. El periodo de almacenamiento de este subproducto permite el enriquecimiento del aceite con los componentes de la piel del fruto y de las hojas del árbol, de gran interés por su actividad biológica, que sólo se encuentran en trazas en el aceite de oliva virgen. Así, el aceite de orujo de oliva centrifugado se enriquece en componentes de la fracción insaponificable que son liposolubles. Aunque una parte de estos compuestos se pierde durante el refinado, en condiciones suaves de refinado pueden retenerse en concentraciones relevantes. Estos componentes incluyen esteroles y tocoferoles, así como los ácidos triterpénicos oleanólico y maslínico.

   En estudios in vitro anteriores, los investigadores demostraron que los compuestos bioactivos del aceite de orujo de oliva alfa-tocoferol, ácido oleanólico y beta-sitosterol eran capaces de atenuar la activación microglial, tanto de forma aislada como como parte de lipoproteínas artificiales ricas en triglicéridos (TRL). La atenuación microglial se determinó midiendo varios marcadores de inflamación y estrés oxidativo, que la célula libera cuando se somete a una estimulación que conduce a una sobreactivación. Este hallazgo abrió la puerta a la posibilidad de que, si estos compuestos bioactivos llegan al cerebro, puedan ayudar a prevenir o ralentizar el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer.

   Luego, los investigadores realizaron un estudio posprandial comparativo para determinar si los TRL humanos obtenidos después de la ingesta de aceite de orujo de oliva podían atenuar la activación microglial en mayor medida que los obtenidos después de la ingesta de aceite de girasol con alto contenido de oleico. Los investigadores encontraron que en ciertos momentos durante el período posprandial, la liberación de marcadores de inflamación y estrés oxidativo por las células microgliales tratadas con TRL era menor cuando se derivaban de la ingesta de aceite de orujo de oliva. Así, se demostró que, en sujetos sanos, el consumo de aceite de orujo durante el período posprandial resulta en la producción de lipoproteínas portadoras de sus compuestos bioactivos y que estos participan en la atenuación de la activación microglial.

   En consecuencia, los investigadores creen que ha llegado el momento de probar nuestra hipótesis en pacientes diagnosticados de enfermedad de Alzheimer, que presentan problemas de memoria o deterioro cognitivo incipiente. Para este proyecto, los investigadores plantean la hipótesis de que estos pacientes tendrán alteraciones en el metabolismo de los lípidos posprandiales que resultarán en TRL con mayor capacidad para sobreactivar la microglía pero que la ingesta de aceite de orujo atenuará esta activación. Si este es el caso, sugeriría que la ingesta de aceite de orujo puede prevenir la neuroinflamación causada por la sobreactivación de la microglía, reduciendo el riesgo de desarrollar y progresar la enfermedad de Alzheimer.

2. HIPÓTESIS DE TRABAJO

   Este proyecto se basa en la demostración de que las TRL, tanto artificiales como de origen humano, son capaces de provocar la activación de la microglía, un fenómeno asociado a enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Además, se ha demostrado que el consumo de aceite de orujo de oliva y sus compuestos bioactivos es capaz de atenuar esta activación. El planteamiento de este proyecto de investigación es que el consumo de aceite de orujo de oliva por parte de pacientes con alzheimer conducirá a la formación de TRL postprandiales que mantengan estos compuestos bioactivos y así conserven su capacidad protectora frente a la activación microglial y la inflamación.

   De ser así, la evidencia obtenida sentaría las bases para el desarrollo de nuevas aplicaciones sanitarias del aceite de orujo, que se basarían en la influencia de los TRL formados en el periodo posprandial y que podrían utilizarse para la prevención y el tratamiento del Alzheimer. enfermedad.

3. OBJETIVOS

Para comprobar la hipótesis anterior se abordarán estos objetivos específicos:

1. Determinar posibles alteraciones en el metabolismo lipídico posprandial en pacientes con enfermedad de Alzheimer leve o diagnosticada en estadio temprano.
2. Evaluar si la ingesta de aceite de orujo es capaz de normalizar estas alteraciones en el metabolismo lipídico posprandial en comparación con el aceite de girasol alto oleico.
3. Obtener y caracterizar la TRL humana obtenida tras la ingesta de aceite de orujo o aceite de girasol alto oleico.
4. Evaluar el efecto atenuante de la activación microglial por TRL obtenida tras la ingesta de aceite de orujo en comparación con el aceite de girasol alto oleico.

4. DISEÑO EXPERIMENTAL Y ACTIVIDADES

El estudio está diseñado como un ensayo cruzado posprandial, aleatorizado, doble ciego en pacientes con Alzheimer, que se dividirán aleatoriamente en dos grupos y se compararán con controles sanos de la misma edad. Todos los sujetos recibirán aceite de orujo y aceite de girasol con alto contenido de oleico.

ACTIVIDAD 1. OBTENCIÓN DE UN ACEITE DE ORUJO RICO EN COMPUESTOS BIOACTIVOS

El aceite de orujo de oliva será aportado por ORIVA, mientras que el aceite de girasol alto oleico será de origen comercial. Ambos aceites serán caracterizados en el Instituto de la Grasa-CSIC para determinar su contenido en alcoholes ácidos y triterpénicos, tocoferoles y esteroles.

ACTIVIDAD 2. SELECCIÓN DE VOLUNTARIOS Y ADMINISTRACIÓN DE LOS ACEITES EXPERIMENTALES

Subactividad 2.1. Selección de voluntarios

El ensayo posprandial se realizará siguiendo los principios fundamentales de la Declaración de Helsinki, el Convenio del Consejo de Europa y la Declaración Universal de la UNESCO y tendrá lugar en el Servicio de Neurología del Hospital Virgen de Valme de Sevilla. Los voluntarios adultos serán seleccionados entre aquellos a los que se les haya diagnosticado la enfermedad de Alzheimer, en función de los resultados de pruebas clínicas y cognitivas utilizando criterios estándar, así como con el uso de biomarcadores específicos. Los criterios de inclusión también incluirán capacidades visuales y auditivas adecuadas y contar con un registro de seguimiento de la evolución de la enfermedad por parte del personal sanitario. Los criterios de exclusión incluirán trastornos psiquiátricos clínicamente significativos; enfermedad o infección sistémica que podría afectar la seguridad; enfermedad cardiovascular en los últimos 2 años; hipertensión no controlada en los últimos 6 meses; cáncer en los últimos 5 años; abuso de drogas o alcohol en los últimos 2 años; y diabetes insulinodependiente.

Para participar, las personas también deberán dar su consentimiento por escrito a un protocolo aprobado por el Comité Ético del Hospital Virgen de Valme, previa información tanto oral como escrita. Se les instará a evitar el consumo de bebidas alcohólicas y tabaco durante el día anterior a la ejecución de las pruebas.

Subactividad 2.2. Determinación del tamaño de la muestra. La variable cuantitativa a examinar en este estudio es la concentración de triglicéridos plasmáticos posprandiales. Suponiendo que la concentración de triglicéridos se reducirá al menos un 10 % como consecuencia de la ingesta de aceite de orujo de oliva en comparación con el aceite de girasol alto oleico y considerando una seguridad del estudio del 95 % (riesgo α 0,05; zα 1,645) y una potencia del 90 % (zβ 1,282), se obtiene un tamaño de muestra de 16 voluntarios. Debido a posibles negativas de los voluntarios (aunque no se esperan efectos adversos), se considera prudente aumentar el tamaño de la muestra a 20 sujetos por grupo.

Subactividad 2.3. Administración de comidas experimentales El día del ensayo, y después de 12 horas de ayuno nocturno, a cada participante se le tomará una muestra de sangre mediante punción de la vena cubital. A continuación recibirán una dosis de aceite de orujo de oliva o de girasol alto oleico, que tomarán como parte de un desayuno que incluye café o leche y tostadas con pan integral. Después de la ingestión, a cada participante se le extraerán alícuotas de sangre cada hora durante un período posprandial de 7 horas. Durante este tiempo se permitirá el libre acceso a la toma de agua.

ACTIVIDAD 3. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LIPOPROTEÍNAS RICAS EN TRIGLICÉRIDOS HUMANOS (TRL)

Subactividad 3.1. Determinaciones en suero sanguíneo De las alícuotas de sangre cubital obtenidas se obtendrá suero por centrifugación y se añadirá NaN3, PMSF y aprotinina como conservantes para evitar la degradación proteolítica. Los sueros se almacenarán a -80 °C hasta su análisis. En suero sanguíneo, la concentración de triglicéridos se determinará mediante espectrofotometría y la concentración de apolipoproteína B mediante inmunoturbidimetría. Estas mediciones permitirán seguir la evolución de la formación y eliminación de TRL posprandiales. Además, se determinarán las concentraciones séricas de ácido oleanólico, alfa-tocoferol y beta-sitosterol. Se seguirá un sistema analítico de extracción y fraccionamiento, utilizando el método GC-MS desarrollado en nuestro laboratorio para la identificación-cuantificación del triterpeno.

Subactividad 3.2. Aislamiento y caracterización de lipoproteínas ricas en triglicéridos (TRL) Se investigará la presencia de ácido oleanólico en TRL aislado por ultracentrifugación de sueros obtenidos en el ensayo posprandial. El contenido de ácidos grasos y TG y apo B48 y B100, como marcadores de la presencia de quilomicrones y VLDL, se determinarán mediante ELISA. Estas mismas partículas se utilizarán para el estudio de activación microglial (Actividad 4).

ACTIVIDAD 4. ACTIVACIÓN MICROGLIAL EN CÉLULAS BV-2 HUMANAS TRATADAS CON TRL En esta actividad se utilizará la línea celular de ratón BV-2 como modelo de células microgliales. Este tipo de células se cultivará en medio DMEM suplementado con 10% de FBS inactivado por calor, estreptomicina (100 mg/ml) y penicilina (100 UI/ml), con 100% de humedad y 5% de CO2. Los experimentos se realizarán en medio reducido de FBS al 5%. Las células se tratarán con TRL obtenidos en el ensayo posprandial. Los tratamientos se mantendrán durante 24h.

Subactividad 4.1. Efecto del TRL humano sobre la viabilidad celular En primer lugar, la viabilidad celular se medirá mediante el método MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). Después de la incubación durante 24 h, las células se lavarán con medio nuevo suplementado con FBS al 5% y se tratarán con TRL durante 12, 24 y 36 h. Las células se lavarán con medio fresco suplementado con FBS al 5% y se tratarán con TRL durante 12, 24 y 36 h. Luego se agregará la solución de MTT. El precipitado de formazán resultante se disolverá en DMSO y la viabilidad celular se cuantificará midiendo la absorbancia a 490 nm.

Subactividad 4.2. Efecto sobre la producción de ROS y la actividad redox. Para determinar la concentración intracelular de ROS. En presencia de ROS, el DCFH se oxida rápidamente para formar diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente. La intensidad de la fluorescencia emitida (excitación de 485 nm, emisión de 825 nm) es proporcional a la concentración intracelular de ROS.

El glutatión total y el glutatión oxidado se determinarán mediante el método enzimático, basado en la actividad GSSG reductasa dependiente de NADPH, que monitoriza espectrofotométricamente el complejo formado por GSH y ácido ditionitrobenzoico (DTNB).

Subactividad 4.3. Efecto de los TRL humanos sobre la producción de citocinas Las células BV-2 se tratarán con TRL posprandiales y la producción de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias en el sobrenadante del cultivo se determinará utilizando kits ELISA comerciales según los protocolos del fabricante.

Subactividad 4.4. Efecto de los TRL humanos sobre la expresión del gen de citoquinas Las células BV-2 se tratarán con TRL posprandiales y se aislará el ARNm. Para determinar la expresión génica de las citocinas de interés se utilizará la técnica de PCR en tiempo real tras retrotranscripción a ADNc, utilizando cebadores diseñados para tal fin.