Atenuação de processos inflamatórios pós-prandiais em pacientes com doença de Alzheimer pelo consumo de óleo de bagaço (CORDIAL)

1. FUNDO

   A doença de Alzheimer (DA) é a causa mais comum de demência e espera-se que a sua prevalência quadruplique até 2050. A doença de Alzheimer é caracterizada patologicamente por perda neuronal substancial e inflamação crônica, que está associada ao acúmulo cerebrovascular e parenquimatoso de depósitos de proteínas enriquecidos em beta-amiloide (Aβ) e proteína Tau hiperfosforilada. O acúmulo de evidências sugere que a interrupção da função da barreira hematoencefálica, que separa o sistema nervoso central da circulação periférica, pode aumentar o risco de aparecimento e piorar o curso da DA.

   Foi proposto que a microglia desempenha um papel crucial na maioria das neuropatologias, uma vez que são ativadas após a detecção de alterações na homeostase cerebral. Este tipo de célula atua como macrófagos residentes no cérebro, examinando constantemente o microambiente local em busca de sinais de infecção e lesão e tornando-se ativado quando encontrado. Como resultado, uma série de mediadores pró-inflamatórios são liberados, incluindo citocinas, espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico. Em contraste, os sistemas de defesa antioxidante, como a glutationa peroxidase-1 e a superóxido dismutase-1, estão diminuídos em pacientes com DA.

   Uma parte significativa do Aβ plasmático está associada a lipoproteínas ricas em triglicerídeos (TRL) que são secretadas por hepatócitos e enterócitos. Estas partículas são caracterizadas pela apolipoproteína B, que serve como indicador de dislipidemia pós-prandial, que é um aumento exagerado, mas transitório, dos TRL após a absorção da gordura dietética e leva à formação de aterosclerose. Este fenômeno pode ser a ligação entre as doenças cardiovasculares e a doença de Alzheimer. A existência de tal ligação já foi demonstrada em estudos clínicos e transversais, mas o mecanismo subjacente permanece obscuro.

   Há evidências acumuladas de que a ingestão de gordura na dieta está associada ao início e à progressão da doença de Alzheimer. Assim, a ingestão de ácidos graxos saturados (SFA) seria um fator deletério, promovendo dislipidemia, disfunção endotelial, inflamação e estresse oxidativo. Em contraste, o consumo de gorduras ricas em ácidos gordos poli ou monoinsaturados (PUFA e MUFA) está associado a uma menor prevalência de doenças, provavelmente como consequência de níveis mais baixos de inflamação sistémica.

   O óleo de bagaço de azeitona é obtido a partir do subproduto sólido da produção de azeite por extração com solvente ou centrifugação. O período de armazenamento deste subproduto permite o enriquecimento do azeite com os componentes da casca do fruto e das folhas das árvores, de grande interesse pela sua atividade biológica, que se encontram apenas em vestígios no azeite virgem. Assim, o óleo de bagaço de azeitona centrifugado é enriquecido em componentes da fração insaponificável que são solúveis em gordura. Embora uma parte destes compostos seja perdida durante o refino, sob condições suaves de refino eles podem ser retidos em concentrações relevantes. Esses componentes incluem esteróis e tocoferóis, bem como os ácidos triterpênicos oleanólico e maslínico.

   Em estudos in vitro anteriores, os investigadores demonstraram que os compostos bioativos do óleo de bagaço de azeitona alfa-tocoferol, ácido oleanólico e beta-sitosterol foram capazes de atenuar a ativação microglial, tanto isoladamente quanto como parte de lipoproteínas artificiais ricas em triglicerídeos (TRL). A atenuação microglial foi determinada medindo vários marcadores de inflamação e estresse oxidativo, que são liberados pela célula quando submetida a estimulação que leva à superativação. Esta descoberta abriu a porta à possibilidade de que, se estes compostos bioativos chegarem ao cérebro, possam ajudar a prevenir ou retardar o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer.

   Os investigadores então conduziram um estudo comparativo pós-prandial para determinar se os TRL humanos obtidos após a ingestão de óleo de bagaço de azeitona foram capazes de atenuar a ativação microglial em maior extensão do que aqueles obtidos após a ingestão de óleo de girassol com alto teor oleico. Os investigadores descobriram que, em determinados momentos durante o período pós-prandial, a libertação de marcadores de inflamação e stress oxidativo pelas células microgliais tratadas com TRL era menor quando eram derivadas da ingestão de óleo de bagaço de azeitona. Assim, foi demonstrado que, em indivíduos saudáveis, o consumo de óleo de bagaço durante o período pós-prandial resulta na produção de lipoproteínas portadoras de seus compostos bioativos e que estes participam na atenuação da ativação microglial.

   Consequentemente, os investigadores acreditam que chegou o momento de testar a nossa hipótese em pacientes com diagnóstico de doença de Alzheimer, que apresentam problemas de memória ou comprometimento cognitivo incipiente. Para este projeto, os investigadores levantam a hipótese de que esses pacientes terão alterações no metabolismo lipídico pós-prandial que resultará em LRT com maior capacidade de superativar a microglia, mas que a ingestão de óleo de bagaço atenuará esta ativação. Se for este o caso, sugeriria que a ingestão de óleo de bagaço pode prevenir a neuroinflamação causada pela hiperativação da micróglia, reduzindo o risco de desenvolver e progredir a doença de Alzheimer.

2. HIPÓTESE DE TRABALHO

   Este projeto baseia-se na demonstração de que os TRL, tanto artificiais como de origem humana, são capazes de provocar a ativação da microglia, fenómeno associado a doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Além disso, o consumo de óleo de bagaço de azeitona e dos seus compostos bioativos demonstrou ser capaz de atenuar esta ativação. A abordagem deste projeto de pesquisa é que o consumo de óleo de bagaço de azeitona por pacientes com Alzheimer levará à formação de LRT pós-prandial que mantêm esses compostos bioativos e assim retêm sua capacidade protetora contra a ativação microglial e inflamação.

   Se for esse o caso, as evidências obtidas lançariam as bases para o desenvolvimento de novas aplicações do óleo de bagaço para a saúde, que se baseariam na influência do TRL formado no período pós-prandial e que poderiam ser utilizadas na prevenção e tratamento da doença de Alzheimer. doença.

3. OBJETIVOS

Para testar a hipótese acima, serão abordados estes objetivos específicos:

1. Determinar possíveis alterações no metabolismo lipídico pós-prandial em pacientes com doença de Alzheimer diagnosticada em estágio leve ou inicial.
2. Avaliar se a ingestão de óleo de bagaço é capaz de normalizar essas alterações no metabolismo lipídico pós-prandial em comparação com óleo de girassol rico em oleico.
3. Obter e caracterizar TRL humano obtido após a ingestão de óleo de bagaço ou óleo de girassol com alto teor oleico.
4. Avaliar o efeito atenuante da ativação microglial por TRL obtido após ingestão de óleo de bagaço em comparação com óleo de girassol com alto teor de oleico.

4. DESENHO EXPERIMENTAL E ATIVIDADES

O estudo foi concebido como um ensaio cruzado pós-prandial, randomizado, duplo-cego, em pacientes com Alzheimer, que serão divididos aleatoriamente em dois grupos e serão comparados com controles saudáveis ​​da mesma idade. Todos os participantes receberão óleo de bagaço e óleo de girassol com alto teor de oleico.

ATIVIDADE 1. OBTENÇÃO DE ÓLEO DE BAGAÇO RICO EM COMPOSTOS BIOATIVOS

O óleo de bagaço de azeitona será fornecido pela ORIVA, enquanto o óleo de girassol com alto teor oleico será de origem comercial. Ambos os óleos serão caracterizados no Instituto de la Grasa-CSIC para determinar seu conteúdo em álcoois ácidos e triterpênicos, tocoferóis e esteróis.

ATIVIDADE 2. SELEÇÃO DE VOLUNTÁRIOS E ADMINISTRAÇÃO DOS ÓLEOS EXPERIMENTAIS

Subatividade 2.1. Seleção de voluntários

O ensaio pós-prandial será realizado seguindo os princípios fundamentais da Declaração de Helsinque, da Convenção do Conselho da Europa e da Declaração Universal da UNESCO e acontecerá no Departamento de Neurologia do Hospital Virgen de Valme em Sevilha. Os voluntários adultos serão selecionados entre aqueles com diagnóstico de doença de Alzheimer, com base nos resultados de testes clínicos e cognitivos utilizando critérios padrão, bem como com o uso de biomarcadores específicos. Os critérios de inclusão também incluirão habilidades visuais e auditivas adequadas e um registro de acompanhamento da evolução da doença pelo pessoal de saúde. Os critérios de exclusão incluirão transtornos psiquiátricos clinicamente significativos; doença ou infecção sistêmica que possa afetar a segurança; doença cardiovascular nos últimos 2 anos; hipertensão não controlada nos últimos 6 meses; câncer nos últimos 5 anos; abuso de drogas ou álcool nos últimos 2 anos; e diabetes dependente de insulina.

Para participação, os indivíduos também são obrigados a dar consentimento por escrito a um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Virgen de Valme, após serem informados oralmente e por escrito. Serão incentivados a evitar o consumo de bebidas alcoólicas e tabaco no dia anterior à realização das provas.

Subatividade 2.2. Determinação do tamanho da amostra. A variável quantitativa a ser examinada neste estudo é a concentração plasmática de triglicerídeos pós-prandial. Assumindo que a concentração de triglicéridos será reduzida em pelo menos 10% como consequência da ingestão de óleo de bagaço de azeitona em comparação com óleo de girassol com alto teor oleico e considerando uma segurança do estudo de 95% (risco α 0,05; zα 1,645) e um poder de 90% (zβ 1,282), obtém-se um tamanho de amostra de 16 voluntários. Devido a possíveis recusas voluntárias (embora não sejam esperados efeitos adversos), considera-se prudente aumentar o tamanho da amostra para 20 indivíduos por grupo.

Subatividade 2.3. Administração de refeições experimentais No dia do ensaio, e após 12 horas de jejum noturno, cada participante receberá uma amostra de sangue colhida por punção da veia cubital. Receberão então uma dose de azeite de bagaço ou óleo de girassol com alto teor oleico, que consumirão no café da manhã, incluindo café ou leite e torradas com pão integral. Após a ingestão, cada participante terá alíquotas de sangue coletadas a cada hora durante um período pós-prandial de 7 horas. Durante este período será permitido o livre acesso à tomada de água.

ATIVIDADE 3. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPOPROTEÍNAS RICAS EM TRIGLICERÍDEOS HUMANOS (TRL)

Subatividade 3.1. Dosagens no soro sanguíneo A partir das alíquotas de sangue cubital obtidas, o soro será obtido por centrifugação e serão adicionados NaN3, PMSF e aprotinina como conservantes para evitar a degradação proteolítica. Os soros serão armazenados a -80 °C até a análise. No soro sanguíneo, a concentração de triglicerídeos será determinada por espectrofotometria e a concentração de apolipoproteína B por imunoturbidimetria. Essas medições permitirão monitorar a evolução da formação e depuração pós-prandial de LRT. Além disso, serão determinadas as concentrações séricas de ácido oleanólico, alfa-tocoferol e beta-sitosterol. Será seguido um sistema analítico de extração e fracionamento, utilizando o método GC-MS desenvolvido em nosso laboratório para identificação-quantificação do triterpeno.

Subatividade 3.2. Isolamento e caracterização de lipoproteínas ricas em triglicerídeos (LRT) Será investigada a presença de ácido oleanólico em LRT isoladas por ultracentrifugação de soros obtidos no ensaio pós-prandial. O teor de ácidos graxos e TG e apo B48 e B100, como marcadores da presença de quilomícrons e VLDL, serão determinados por ELISA. Essas mesmas partículas serão utilizadas para o estudo de ativação microglial (Atividade 4).

ATIVIDADE 4. ATIVAÇÃO MICROGLIAL EM CÉLULAS BV-2 HUMANAS TRATADAS COM TRL Nesta atividade, a linha celular de camundongo BV-2 será usada como modelo de células microgliais. Este tipo de célula será cultivado em meio DMEM suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor, estreptomicina (100 mg/ml) e penicilina (100 UI/ml), sob 100% de umidade e 5% de CO2. Os experimentos serão realizados em meio reduzido com 5% de FBS. As células serão tratadas com LRTs obtidos no ensaio pós-prandial. Os tratamentos serão mantidos por 24h.

Subatividade 4.1. Efeito dos TRL humanos na viabilidade celular Em primeiro lugar, a viabilidade celular será medida pelo método MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio). Após incubação por 24 horas, as células serão lavadas com meio fresco suplementado com 5% de FBS e tratadas com TRL por 12, 24 e 36 horas. As células serão lavadas com meio fresco suplementado com 5% de FBS e tratadas com TRL por 12, 24 e 36 h. A solução MTT deve então ser adicionada. O precipitado de formazan resultante será dissolvido em DMSO e a viabilidade celular será quantificada medindo a absorbância a 490 nm.

Subatividade 4.2. Efeito na produção de ERO e atividade redox A sonda fluorescente 2',7'-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA), que se difunde através da membrana celular e é hidrolisada por esterases intracelulares para formar DCFH não fluorescente, será usada para determinar o concentração intracelular de ROS. Na presença de ROS, o DCFH é rapidamente oxidado para formar diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente. A intensidade da fluorescência emitida (excitação de 485 nm, emissão de 825 nm) é proporcional à concentração intracelular de ROS.

A glutationa total e a glutationa oxidada serão determinadas pelo método enzimático, baseado na atividade da GSSG redutase dependente de NADPH, que monitora espectrofotometricamente o complexo formado por GSH e ácido ditionitrobenzóico (DTNB).

Subatividade 4.3. Efeito das LRTs humanas na produção de citocinas As células BV-2 serão tratadas com LRTs pós-prandiais e a produção de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias no sobrenadante da cultura será determinada utilizando kits comerciais de ELISA de acordo com os protocolos do fabricante.

Subatividade 4.4. Efeito das LRTs humanas na expressão gênica de citocinas As células BV-2 serão tratadas com LRTs pós-prandiais e o mRNA será isolado. Para determinar a expressão gênica das citocinas de interesse será utilizada a técnica de PCR em tempo real após retrotranscrição para cDNA, utilizando primers desenhados para esse fim.