Attenuazione dei processi infiammatori postprandiali nei pazienti con malattia di Alzheimer mediante consumo di olio di sansa (CORDIAL)

1. SFONDO

   La malattia di Alzheimer (AD) è la causa più comune di demenza e si prevede che la sua prevalenza quadruplicherà entro il 2050. L'Alzheimer è caratterizzato patologicamente da una sostanziale perdita neuronale e da un'infiammazione cronica, associata all'accumulo cerebrovascolare e parenchimale di depositi proteici arricchiti in beta-amiloide (Aβ) e proteina Tau iperfosforilata. Prove sempre più numerose suggeriscono che l'interruzione della funzione della barriera emato-encefalica, che separa il sistema nervoso centrale dalla circolazione periferica, può aumentare il rischio di insorgenza e peggiorare il decorso dell'AD.

   È stato proposto che le microglia svolgano un ruolo cruciale nella maggior parte delle neuropatologie, poiché si attivano quando vengono rilevate alterazioni nell'omeostasi cerebrale. Questo tipo di cellule agisce come macrofagi residenti nel cervello, scansionando costantemente il microambiente locale alla ricerca di segni di infezioni e lesioni e attivandosi quando vengono trovati. Di conseguenza, vengono rilasciati una serie di mediatori pro-infiammatori, tra cui citochine, specie reattive dell’ossigeno (ROS) e ossido nitrico. Al contrario, i sistemi di difesa antiossidanti, come la glutatione perossidasi-1 e la superossido dismutasi-1, sono diminuiti nei pazienti con AD.

   Una parte significativa dell’Aβ plasmatica è associata alle lipoproteine ​​ricche di trigliceridi (TRL) secrete dagli epatociti e dagli enterociti. Queste particelle sono caratterizzate dall'apolipoproteina B, che funge da indicatore della dislipidemia postprandiale, che è un aumento esagerato ma transitorio dei TRL dopo l'assorbimento dei grassi con la dieta e porta alla formazione di aterosclerosi. Questo fenomeno potrebbe essere il collegamento tra le malattie cardiovascolari e il morbo di Alzheimer. L’esistenza di tale collegamento è già stata dimostrata in studi clinici e trasversali, ma il meccanismo sottostante rimane poco chiaro.

   Sono sempre più numerose le prove che l'assunzione di grassi con la dieta è associata all'insorgenza e alla progressione della malattia di Alzheimer. Pertanto, l’assunzione di acidi grassi saturi (SFA) sarebbe un fattore deleterio, favorendo la dislipidemia, la disfunzione endoteliale, l’infiammazione e lo stress ossidativo. Al contrario, il consumo di grassi ricchi di acidi grassi poli- o monoinsaturi (PUFA e MUFA) è associato a una minore prevalenza della malattia, probabilmente come conseguenza di livelli più bassi di infiammazione sistemica.

   L'olio di sansa di oliva è ottenuto dal sottoprodotto solido della produzione di olio d'oliva mediante estrazione con solvente o centrifugazione. Il periodo di conservazione di questo sottoprodotto permette di arricchire l'olio con i componenti della buccia del frutto e delle foglie degli alberi, di grande interesse per la loro attività biologica, che si trovano solo in tracce nell'olio vergine di oliva. L'olio di sansa di oliva centrifugato si arricchisce così di componenti liposolubili della frazione insaponificabile. Sebbene una parte di questi composti venga persa durante la raffinazione, in condizioni di raffinazione blande possono essere trattenuti in concentrazioni rilevanti. Questi componenti includono steroli e tocoferoli, nonché gli acidi triterpenici oleanolico e maslinico.

   In precedenti studi in vitro i ricercatori hanno dimostrato che i composti bioattivi presenti nell’olio di sansa di oliva alfa-tocoferolo, acido oleanolico e beta-sitosterolo erano in grado di attenuare l’attivazione microgliale, sia isolatamente che come parte delle lipoproteine ​​artificiali ricche di trigliceridi (TRL). L'attenuazione microgliale è stata determinata misurando vari marcatori di infiammazione e stress ossidativo, che vengono rilasciati dalla cellula quando sottoposta a stimolazione che porta a un'eccessiva attivazione. Questa scoperta ha aperto la porta alla possibilità che, se questi composti bioattivi raggiungono il cervello, potrebbero aiutare a prevenire o rallentare lo sviluppo di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer.

   I ricercatori hanno quindi condotto uno studio comparativo postprandiale per determinare se i TRL umani ottenuti dopo l’assunzione di olio di sansa di oliva fossero in grado di attenuare l’attivazione microgliale in misura maggiore rispetto a quelli ottenuti dopo l’assunzione di olio di girasole ad alto contenuto oleico. I ricercatori hanno scoperto che in determinati momenti durante il periodo postprandiale, il rilascio di marcatori di infiammazione e stress ossidativo da parte delle cellule microgliali trattate con TRL era inferiore quando derivavano dall’assunzione di olio di sansa di oliva. È stato così dimostrato che, in soggetti sani, il consumo di olio di sansa durante il periodo postprandiale determina la produzione di lipoproteine ​​che trasportano i suoi composti bioattivi e che queste partecipano all’attenuazione dell’attivazione microgliale.

   Di conseguenza, i ricercatori ritengono che sia giunto il momento di testare la nostra ipotesi in pazienti con diagnosi di morbo di Alzheimer, che presentano problemi di memoria o deterioramento cognitivo incipiente. Per questo progetto, i ricercatori ipotizzano che questi pazienti presenteranno alterazioni nel metabolismo lipidico postprandiale che si tradurranno in TRL con una maggiore capacità di sovraattivare la microglia ma che l'assunzione di olio di sansa attenuerà questa attivazione. Se così fosse, ciò suggerirebbe che l’assunzione di olio di sansa potrebbe prevenire la neuroinfiammazione causata dall’iperattivazione della microglia, riducendo il rischio di sviluppare e far progredire la malattia di Alzheimer.

2. IPOTESI DI LAVORO

   Questo progetto si basa sulla dimostrazione che le TRL, sia artificiali che di origine umana, sono in grado di provocare l'attivazione della microglia, un fenomeno associato a malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer. Inoltre, il consumo di olio di sansa di oliva e dei suoi composti bioattivi ha dimostrato di essere in grado di attenuare questa attivazione. L'approccio di questo progetto di ricerca è che il consumo di olio di sansa di oliva da parte dei pazienti affetti da Alzheimer porterà alla formazione di TRL postprandiali che mantengono questi composti bioattivi e quindi mantengono la loro capacità protettiva contro l'attivazione e l'infiammazione della microglia.

   Se così fosse, le evidenze ottenute getterebbero le basi per lo sviluppo di nuove applicazioni sanitarie dell’olio di sansa, che si baserebbero sull’influenza dei TRL formati nel periodo postprandiale e che potrebbero essere utilizzate per la prevenzione e la cura dell’Alzheimer malattia.

3. OBIETTIVI

Per testare l’ipotesi di cui sopra, verranno affrontati questi obiettivi specifici:

1. Determinare possibili alterazioni nel metabolismo lipidico postprandiale in pazienti con malattia di Alzheimer diagnosticata in fase lieve o precoce.
2. Valutare se l'assunzione di olio di sansa è in grado di normalizzare queste alterazioni del metabolismo lipidico postprandiale rispetto all'olio di girasole alto-oleico.
3. Ottenere e caratterizzare le TRL umane ottenute dopo l'ingestione di olio di sansa o olio di girasole alto oleico.
4. Valutare l'effetto attenuante dell'attivazione microgliale da parte di TRL ottenuta dopo l'ingestione di olio di sansa rispetto all'olio di girasole alto oleico.

4. PROGETTAZIONE E ATTIVITÀ SPERIMENTALI

Lo studio è concepito come uno studio randomizzato, in doppio cieco, crossover postprandiale su pazienti con malattia di Alzheimer, che saranno divisi casualmente in due gruppi e saranno confrontati con controlli sani della stessa età. Tutti i soggetti riceveranno olio di sansa e un olio di girasole alto oleico.

ATTIVITÀ 1. OTTENERE UN OLIO DI SANSA RICCO DI COMPOSTI BIOATTIVI

L'olio di sansa di oliva sarà fornito da ORIVA, mentre l'olio di girasole alto oleico sarà di origine commerciale. Entrambi gli oli saranno caratterizzati presso l'Instituto de la Grasa-CSIC per determinarne il contenuto in alcoli acidi e triterpenici, tocoferoli e steroli.

ATTIVITÀ 2. SELEZIONE DEI VOLONTARI E SOMMINISTRAZIONE DEGLI OLI SPERIMENTALI

Sottoattività 2.1. Selezione dei volontari

Lo studio postprandiale sarà eseguito seguendo i principi fondamentali della Dichiarazione di Helsinki, della Convenzione del Consiglio d'Europa e della Dichiarazione Universale dell'UNESCO e si svolgerà presso il Dipartimento di Neurologia dell'Ospedale Virgen de Valme di Siviglia. I volontari adulti saranno selezionati tra quelli a cui è stata diagnosticata la malattia di Alzheimer, sulla base dei risultati di test clinici e cognitivi utilizzando criteri standard e con l'uso di biomarcatori specifici. I criteri di inclusione includeranno anche adeguate capacità visive e uditive e il controllo dell'evoluzione della malattia da parte del personale sanitario. I criteri di esclusione includeranno disturbi psichiatrici clinicamente significativi; malattia sistemica o infezione che potrebbe compromettere la sicurezza; malattia cardiovascolare negli ultimi 2 anni; ipertensione incontrollata negli ultimi 6 mesi; cancro negli ultimi 5 anni; abuso di droghe o alcol negli ultimi 2 anni; e diabete insulino-dipendente.

Per la partecipazione, le persone sono inoltre tenute a dare il consenso scritto ad un protocollo approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Virgen de Valme, dopo essere state informate oralmente e per iscritto. Saranno incoraggiati ad evitare il consumo di bevande alcoliche e tabacco nel giorno precedente lo svolgimento delle prove.

Sottoattività 2.2. Determinazione della dimensione del campione. La variabile quantitativa da esaminare in questo studio è la concentrazione di trigliceridi plasmatici postprandiali. Supponendo che la concentrazione di trigliceridi venga ridotta di almeno il 10% in conseguenza del consumo di olio di sansa di oliva rispetto all'olio di girasole alto oleico e considerando una sicurezza dello studio del 95% (rischio α 0,05; zα 1,645) e un potere del 90% (zβ 1.282), si ottiene una dimensione del campione di 16 volontari. A causa di possibili rifiuti da parte dei volontari (sebbene non siano previsti effetti avversi), si è ritenuto prudente aumentare la dimensione del campione a 20 soggetti per gruppo.

Sottoattività 2.3. Somministrazione dei pasti sperimentali Il giorno della sperimentazione, e dopo 12 ore di digiuno notturno, a ciascun partecipante verrà prelevato un campione di sangue mediante puntura della vena cubitale. Riceveranno poi una dose di olio di sansa di oliva o di olio di girasole alto oleico, che consumeranno nell'ambito di una colazione a base di caffè o latte e pane tostato con pane integrale. Dopo l'ingestione, a ciascun partecipante verranno prelevate aliquote di sangue ogni ora per un periodo postprandiale di 7 ore. Durante questo periodo sarà consentito il libero accesso alla presa d'acqua.

ATTIVITÀ 3. ISOLAMENTO E CARATTERIZZAZIONE DI LIPOPROTEINE RICCHE DI TRIGLICERIDI UMANI (TRL)

Sottoattività 3.1. Determinazioni nel siero sanguigno Dalle aliquote di sangue cubitale ottenute, si otterrà il siero mediante centrifugazione e si aggiungeranno NaN3, PMSF e aprotinina come conservanti per evitare la degradazione proteolitica. I sieri verranno conservati a -80°C fino al momento dell'analisi. Nel siero del sangue, la concentrazione dei trigliceridi sarà determinata mediante spettrofotometria e la concentrazione dell'apolipoproteina B mediante immunoturbidimetria. Queste misurazioni consentiranno di monitorare l'evoluzione della formazione e dell'eliminazione dei TRL postprandiali. Verranno inoltre determinate le concentrazioni sieriche di acido oleanolico, alfa-tocoferolo e beta-sitosterolo. Verrà seguito un sistema analitico di estrazione e frazionamento, utilizzando il metodo GC-MS sviluppato nel nostro laboratorio per l'identificazione-quantificazione del triterpene.

Sottoattività 3.2. Isolamento e caratterizzazione di lipoproteine ​​ricche di trigliceridi (TRL) Verrà studiata la presenza di acido oleanolico nelle TRL isolate mediante ultracentrifugazione di sieri ottenuti nel test postprandiale. Il contenuto di acidi grassi, TG e apo B48 e B100, come marcatori per la presenza di chilomicroni e VLDL, sarà determinato mediante ELISA. Queste stesse particelle verranno utilizzate per lo studio sull'attivazione microgliale (Attività 4).

ATTIVITÀ 4. ATTIVAZIONE MICROGLIALE IN CELLULE BV-2 TRATTATE CON TRL UMANA In questa attività, la linea cellulare murina BV-2 sarà utilizzata come modello cellulare microgliale. Questo tipo cellulare verrà coltivato in terreno DMEM integrato con FBS inattivato al calore al 10%, streptomicina (100 mg/ml) e penicillina (100 UI/ml), sotto il 100% di umidità e il 5% di CO2. Gli esperimenti verranno eseguiti in terreno ridotto con FBS al 5%. Le cellule verranno trattate con i TRL ottenuti nel saggio postprandiale. I trattamenti verranno mantenuti per 24 ore.

Sottoattività 4.1. Effetto del TRL umano sulla vitalità cellulare Innanzitutto, la vitalità cellulare deve essere misurata con il metodo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). Dopo l'incubazione per 24 ore, le cellule verranno lavate con terreno fresco arricchito con il 5% di FBS e trattate con TRL per 12, 24 e 36 ore. Le cellule verranno lavate con mezzo fresco arricchito con il 5% di FBS e trattate con TRL per 12, 24 e 36 ore. Verrà quindi aggiunta la soluzione MTT. Il precipitato di formazan risultante sarà sciolto in DMSO e la vitalità cellulare sarà quantificata misurando l'assorbanza a 490 nm.

Sottoattività 4.2. Effetto sulla produzione di ROS e sull'attività redox La sonda fluorescente 2',7'-diclorofluoresceina-diacetato (DCFH-DA), che diffonde attraverso la membrana cellulare e viene idrolizzata dalle esterasi intracellulari per formare DCFH non fluorescente, verrà utilizzata per determinare l'attività redox concentrazione intracellulare di ROS. In presenza di ROS, il DCFH viene rapidamente ossidato per formare diclorofluoresceina (DCF) altamente fluorescente. L'intensità della fluorescenza emessa (eccitazione 485 nm, emissione 825 nm) è proporzionale alla concentrazione intracellulare di ROS.

Il glutatione totale e il glutatione ossidato saranno determinati con il metodo enzimatico, basato sull'attività della GSSG reduttasi NADPH-dipendente, che monitora spettrofotometricamente il complesso formato da GSH e acido ditionitrobenzoico (DTNB).

Sottoattività 4.3. Effetto dei TRL umani sulla produzione di citochine Le cellule BV-2 saranno trattate con TRL postprandiali e la produzione di citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatorie nel surnatante della coltura sarà determinata utilizzando kit ELISA commerciali secondo i protocolli del produttore.

Sottoattività 4.4. Effetto dei TRL umani sull'espressione genica delle citochine Le cellule BV-2 saranno trattate con TRL postprandiali e l'mRNA sarà isolato. Per determinare l'espressione genica delle citochine di interesse verrà utilizzata la tecnica della real-time PCR previa retrotrascrizione a cDNA, utilizzando primer progettati a questo scopo.