Verzwakking van postprandiale ontstekingsprocessen bij patiënten met de ziekte van Alzheimer door consumptie van afvallenolie (CORDIAL)

1. ACHTERGROND

   De ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende oorzaak van dementie en de prevalentie ervan zal naar verwachting tegen 2050 verviervoudigen. De ziekte van Alzheimer wordt pathologisch gekenmerkt door substantieel neuronaal verlies en chronische ontsteking, die gepaard gaat met cerebrovasculaire en parenchymale accumulatie van eiwitafzettingen verrijkt met amyloïde-bèta (Aβ) en hypergefosforyleerd Tau-eiwit. Steeds meer bewijs suggereert dat verstoring van de bloed-hersenbarrièrefunctie, die het centrale zenuwstelsel scheidt van de perifere bloedsomloop, het risico op het ontstaan ​​van AD kan vergroten en het beloop kan verergeren.

   Er is voorgesteld dat microglia een cruciale rol spelen bij de meeste neuropathologieën, omdat ze worden geactiveerd bij detectie van veranderingen in de homeostase van de hersenen. Dit celtype gedraagt ​​zich als macrofagen in de hersenen die voortdurend de lokale micro-omgeving scannen op tekenen van infectie en letsel en worden geactiveerd wanneer ze worden aangetroffen. Als gevolg hiervan komt een groot aantal pro-inflammatoire mediatoren vrij, waaronder cytokines, reactieve zuurstofsoorten (ROS) en stikstofmonoxide. Daarentegen zijn antioxidantafweersystemen, zoals glutathionperoxidase-1 en superoxide-dismutase-1, verminderd bij AD-patiënten.

   Een aanzienlijk deel van plasma-Aβ is geassocieerd met triglyceridenrijke lipoproteïnen (TRL) die worden uitgescheiden door hepatocyten en enterocyten. Deze deeltjes worden gekenmerkt door apolipoproteïne B, dat dient als indicator voor postprandiale dyslipidemie, wat een overdreven maar voorbijgaande stijging van de TRL is na opname van vet uit de voeding en leidt tot de vorming van atherosclerose. Dit fenomeen zou het verband kunnen zijn tussen hart- en vaatziekten en de ziekte van Alzheimer. Het bestaan ​​van een dergelijk verband is al aangetoond in klinische en cross-sectionele onderzoeken, maar het onderliggende mechanisme blijft onduidelijk.

   Er zijn steeds meer aanwijzingen dat de inname van vet via de voeding verband houdt met het ontstaan ​​en de progressie van de ziekte van Alzheimer. De inname van verzadigde vetzuren (SFA) zou dus een schadelijke factor zijn, die dyslipidemie, endotheliale disfunctie, ontstekingen en oxidatieve stress bevordert. Daarentegen wordt de consumptie van vetten die rijk zijn aan poly- of enkelvoudig onverzadigde vetzuren (PUFA en MUFA) geassocieerd met een lagere ziekteprevalentie, waarschijnlijk als gevolg van lagere niveaus van systemische ontstekingen.

   Olie uit afvallen van olijven wordt verkregen uit het vaste bijproduct van de productie van olijfolie door oplosmiddelextractie of centrifugatie. De bewaarperiode van dit bijproduct maakt de verrijking van de olie mogelijk met de componenten van de fruitschillen en boombladeren, die van groot belang zijn vanwege hun biologische activiteit, die alleen in sporen wordt aangetroffen in olijfolie van eerste persing. Zo wordt gecentrifugeerde olie uit afvallen van olijven verrijkt met componenten van de onverzeepbare fractie die in vet oplosbaar zijn. Hoewel een deel van deze verbindingen tijdens de raffinage verloren gaat, kunnen ze onder milde raffinageomstandigheden in relevante concentraties achterblijven. Deze componenten omvatten sterolen en tocoferolen, evenals de triterpeenzuren, oleanol- en maslinezuur.

   In eerdere in vitro onderzoeken hebben de onderzoekers aangetoond dat de bioactieve verbindingen in alfa-tocoferol, oleanolzuur en beta-sitosterol van olie uit afvallen van olijven in staat waren de microgliale activering te verzwakken, zowel afzonderlijk als als onderdeel van kunstmatige triglyceridenrijke lipoproteïnen (TRL). Microgliale verzwakking werd bepaald door het meten van verschillende markers van ontsteking en oxidatieve stress, die vrijkomen door de cel wanneer deze wordt onderworpen aan stimulatie die tot overactivatie leidt. Deze bevinding opende de deur voor de mogelijkheid dat, als deze bioactieve stoffen de hersenen bereiken, ze de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer kunnen helpen voorkomen of vertragen.

   De onderzoekers voerden vervolgens een vergelijkend postprandiaal onderzoek uit om te bepalen of menselijke TRL verkregen na inname van olie uit afvallen van olijven in staat was de microgliale activering in grotere mate te verzwakken dan die verkregen na inname van zonnebloemolie met een hoog oliezuurgehalte. De onderzoekers ontdekten dat op bepaalde momenten tijdens de postprandiale periode de afgifte van markers van ontsteking en oxidatieve stress door microgliale cellen behandeld met TRL lager was wanneer ze afkomstig waren van de inname van olie uit afvallen van olijven. Zo werd aangetoond dat bij gezonde proefpersonen de consumptie van olie uit afvallen tijdens de postprandiale periode resulteert in de productie van lipoproteïnen die de bioactieve verbindingen ervan dragen en dat deze deelnemen aan de verzwakking van microgliale activering.

   Daarom zijn de onderzoekers van mening dat de tijd is aangebroken om onze hypothese te testen bij patiënten bij wie de ziekte van Alzheimer is vastgesteld en die geheugenproblemen of beginnende cognitieve stoornissen vertonen. Voor dit project veronderstellen de onderzoekers dat deze patiënten veranderingen zullen hebben in het postprandiale lipidenmetabolisme die zullen resulteren in TRL met een groter vermogen om microglia te overactiveren, maar dat de inname van afvallenolie deze activering zal verzwakken. Als dit het geval is, zou dit erop kunnen wijzen dat de inname van afvallenolie neuro-ontsteking kan voorkomen die wordt veroorzaakt door overactivatie van microglia, waardoor het risico op het ontwikkelen en verergeren van de ziekte van Alzheimer wordt verminderd.

2. WERKHYPOTHESE

   Dit project is gebaseerd op de demonstratie dat TRL, zowel kunstmatig als van menselijke oorsprong, in staat is de activering van microglia op te wekken, een fenomeen dat geassocieerd wordt met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer. Bovendien is aangetoond dat de consumptie van olie uit afvallen van olijven en de bioactieve verbindingen deze activering kan verzwakken. De aanpak van dit onderzoeksproject is dat de consumptie van olie uit afvallen van olijven door Alzheimerpatiënten zal leiden tot de vorming van postprandiale TRL's die deze bioactieve verbindingen in stand houden en zo hun beschermende vermogen tegen microgliale activering en ontsteking behouden.

   Als dit het geval is, zou het verkregen bewijsmateriaal de basis leggen voor de ontwikkeling van nieuwe gezondheidstoepassingen van afvallenolie, die gebaseerd zouden zijn op de invloed van TRL gevormd in de postprandiale periode en die gebruikt zouden kunnen worden voor de preventie en behandeling van de ziekte van Alzheimer. ziekte.

3. DOELSTELLINGEN

Om de bovenstaande hypothese te testen, zullen deze specifieke doelstellingen worden aangepakt:

1. Om mogelijke veranderingen in het postprandiale lipidenmetabolisme te bepalen bij patiënten met milde of vroeg gediagnosticeerde ziekte van Alzheimer.
2. Om te beoordelen of de inname van afvallenolie in staat is deze veranderingen in het postprandiale lipidenmetabolisme te normaliseren in vergelijking met zonnebloemolie met een hoog oliezuurgehalte.
3. Voor het verkrijgen en karakteriseren van menselijke TRL verkregen na de inname van olie uit afvallen of zonnebloemolie met een hoog oliezuurgehalte.
4. Om het verzachtende effect te evalueren van microgliale activering door TRL verkregen na inname van afvallenolie in vergelijking met zonnebloemolie met een hoog oliezuurgehalte.

4. EXPERIMENTEEL ONTWERP EN ACTIVITEITEN

De studie is opgezet als een gerandomiseerde, dubbelblinde, postprandiale cross-over studie bij Alzheimerpatiënten, die willekeurig in twee groepen zal worden verdeeld en zal worden vergeleken met gezonde controles van dezelfde leeftijd. Alle proefpersonen krijgen afvallenolie en zonnebloemolie met een hoog oliezuurgehalte.

ACTIVITEIT 1. VERKRIJGEN VAN EEN OLIE VAN POMACE DIE RIJK IS AAN BIOACTIEVE VERBINDINGEN

De olie uit afvallen van olijven zal worden geleverd door ORIVA, terwijl de zonnebloemolie met een hoog oliezuurgehalte van commerciële oorsprong zal zijn. Beide oliën zullen worden gekarakteriseerd door het Instituto de la Grasa-CSIC om hun gehalte aan zure en triterpeenalcoholen, tocoferolen en sterolen te bepalen.

ACTIVITEIT 2. SELECTIE VAN VRIJWILLIGERS EN TOEDIENING VAN DE EXPERIMENTELE OLIËN

Deelactiviteit 2.1. Selectie van vrijwilligers

Het postprandiale onderzoek zal worden uitgevoerd volgens de fundamentele principes van de Verklaring van Helsinki, het Verdrag van de Raad van Europa en de Universele Verklaring van UNESCO en zal plaatsvinden op de afdeling Neurologie van het Ziekenhuis Virgen de Valme in Sevilla. Volwassen vrijwilligers zullen worden geselecteerd uit degenen bij wie de ziekte van Alzheimer is vastgesteld, op basis van de resultaten van klinische en cognitieve tests met behulp van standaardcriteria en met het gebruik van specifieke biomarkers. Inclusiecriteria omvatten ook adequate visuele en gehoorvaardigheden en het beschikken over een vervolgregistratie van de evolutie van de ziekte door gezondheidszorgpersoneel. Uitsluitingscriteria omvatten klinisch significante psychiatrische stoornissen; systemische ziekte of infectie die de veiligheid zou kunnen beïnvloeden; hart- en vaatziekten in de afgelopen 2 jaar; ongecontroleerde hypertensie in de afgelopen 6 maanden; kanker in de afgelopen 5 jaar; drugs- of alcoholmisbruik in de afgelopen 2 jaar; en insuline-afhankelijke diabetes.

Voor deelname moeten individuen ook schriftelijk toestemming geven voor een protocol dat is goedgekeurd door de ethische commissie van het Virgen de Valme-ziekenhuis, nadat ze zowel mondeling als schriftelijk op de hoogte zijn gesteld. Zij zullen worden aangemoedigd om de consumptie van alcoholische dranken en tabak te vermijden gedurende de dag voorafgaand aan de uitvoering van de processen.

Deelactiviteit 2.2. Bepaling van de steekproefomvang. De kwantitatieve variabele die in dit onderzoek moet worden onderzocht, is de postprandiale plasmatriglyceridenconcentratie. Ervan uitgaande dat de triglyceridenconcentratie met ten minste 10% zal worden verlaagd als gevolg van de inname van olie uit afvallen van olijven in vergelijking met zonnebloemolie met een hoog oliezuurgehalte en rekening houdend met een onderzoeksveiligheid van 95% (risico α 0,05; zα 1,645) en een power van 90% (zβ 1,282), wordt een steekproefomvang van 16 vrijwilligers verkregen. Vanwege mogelijke weigeringen van vrijwilligers (hoewel er geen nadelige effecten worden verwacht), wordt het verstandig geacht de steekproefomvang te vergroten tot 20 proefpersonen per groep.

Deelactiviteit 2.3. Toediening van experimentele maaltijden Op de dag van de proef, en na 12 uur nachtelijk vasten, zal bij elke deelnemer een bloedmonster worden afgenomen door een punctie van de cubitale ader. Ze krijgen dan een dosis olijfolie uit afvallen of zonnebloemolie met een hoog oliezuurgehalte, die ze eten als onderdeel van een ontbijt inclusief koffie of melk en toast met volkorenbrood. Na inname worden bij elke deelnemer elk uur bloedmonsters afgenomen gedurende een postprandiale periode van 7 uur. Gedurende deze tijd is gratis toegang tot waterinname toegestaan.

ACTIVITEIT 3. ISOLATIE EN KARAKTERISERING VAN MENSELIJKE TRIGLYCERIDE-RIJKE LIPOPROTEÏNEN (TRL)

Deelactiviteit 3.1. Bepalingen in bloedserum Uit de verkregen hoeveelheden cubitaal bloed wordt serum verkregen door centrifugatie en worden NaN3, PMSF en aprotinine toegevoegd als conserveermiddelen om proteolytische afbraak te voorkomen. De sera worden tot analyse bij -80 °C bewaard. In bloedserum zal de triglyceridenconcentratie worden bepaald door spectrofotometrie en de apolipoproteïne B-concentratie door immunoturbidimetrie. Deze metingen zullen het monitoren van de evolutie van postprandiale TRL-vorming en -klaring mogelijk maken. Daarnaast zullen serumconcentraties van oleanolzuur, alfa-tocoferol en beta-sitosterol worden bepaald. Er zal een analytisch extractie- en fractionatiesysteem gevolgd worden, waarbij gebruik gemaakt wordt van de GC-MS-methode ontwikkeld in ons laboratorium voor de identificatie-kwantificering van de triterpeen.

Deelactiviteit 3.2. Isolatie en karakterisering van triglyceridenrijke lipoproteïnen (TRL) De aanwezigheid van oleanolzuur in TRL geïsoleerd door ultracentrifugatie van sera verkregen in de postprandiale test zal onderzocht worden. Het vetzuur- en TG-gehalte en apo B48 en B100, als markers voor de aanwezigheid van chylomicronen en VLDL, zullen worden bepaald door middel van ELISA. Deze zelfde deeltjes zullen worden gebruikt voor het onderzoek naar microgliale activatie (Activiteit 4).

ACTIVITEIT 4. MICROGLIALE ACTIVERING IN MENSELIJKE TRL-BEHANDELDE BV-2 CELLEN In deze activiteit zal de muiscellijn BV-2 worden gebruikt als een microgliale celmodel. Dit celtype zal worden gekweekt in DMEM-medium aangevuld met 10% door hitte geïnactiveerde FBS, streptomycine (100 mg/ml) en penicilline (100 IU/ml), onder een vochtigheid van 100% en 5% CO2. Experimenten zullen worden uitgevoerd in medium met 5% FBS-reductie. Cellen zullen worden behandeld met TRL's verkregen in de postprandiale test. Behandelingen worden 24 uur voortgezet.

Deelactiviteit 4.1. Effect van menselijke TRL op de levensvatbaarheid van de cellen Ten eerste moet de levensvatbaarheid van de cellen worden gemeten met de MTT-methode (3-(4,5-dimethylthiazool-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium). Na 24 uur incubatie worden de cellen gewassen met vers medium aangevuld met 5% FBS en gedurende 12, 24 en 36 uur behandeld met TRL. De cellen worden gewassen met vers medium aangevuld met 5% FBS en behandeld met TRL gedurende 12, 24 en 36 uur. Vervolgens wordt de MTT-oplossing toegevoegd. Het resulterende formazanprecipitaat zal worden opgelost in DMSO en de levensvatbaarheid van de cellen zal worden gekwantificeerd door de absorptie bij 490 nm te meten.

Deelactiviteit 4.2. Effect op ROS-productie en redoxactiviteit De fluorescerende probe 2',7'-dichloorfluoresceïne-diacetaat (DCFH-DA), die door het celmembraan diffundeert en door intracellulaire esterasen wordt gehydrolyseerd om niet-fluorescerende DCFH te vormen, zal worden gebruikt om de intracellulaire concentratie van ROS. In aanwezigheid van ROS wordt DCFH snel geoxideerd tot sterk fluorescerend dichloorfluoresceïne (DCF). De intensiteit van de uitgezonden fluorescentie (485 nm excitatie, 825 nm emissie) is evenredig met de intracellulaire concentratie van ROS.

Zowel totaal glutathion als geoxideerd glutathion zullen worden bepaald via de enzymatische methode, gebaseerd op de NADPH-afhankelijke GSSG-reductase-activiteit, die spectrofotometrisch het complex gevormd door GSH en dithionitrobenzoëzuur (DTNB) volgt.

Deelactiviteit 4.3. Effect van menselijke TRL's op cytokineproductie BV-2-cellen zullen worden behandeld met postprandiale TRL's en de productie van pro-inflammatoire en anti-inflammatoire cytokines in het kweeksupernatant zal worden bepaald met behulp van commerciële ELISA-kits volgens de protocollen van de fabrikant.

Deelactiviteit 4.4. Effect van menselijke TRL's op cytokinegenexpressie. BV-2-cellen zullen worden behandeld met postprandiale TRL's en mRNA zal worden geïsoleerd. Om de genexpressie van de cytokinen van belang te bepalen, zal de real-time PCR-techniek na retrotranscriptie naar cDNA gebruikt worden, waarbij gebruik gemaakt wordt van primers die voor dit doel ontworpen zijn.