Dempning av postprandiale inflammatoriske prosesser hos pasienter med Alzheimers sykdom ved forbruk av avfallsolje (CORDIAL)

1. BAKGRUNN

   Alzheimers sykdom (AD) er den vanligste årsaken til demens, og prevalensen forventes å firedobles innen 2050. Alzheimers er patologisk karakterisert av betydelig nevronalt tap og kronisk betennelse, som er assosiert med cerebrovaskulær og parenkymal akkumulering av proteinavleiringer anriket på amyloid-beta (Aβ) og hyperfosforylert Tau-protein. Akkumulerende bevis tyder på at forstyrrelse av blod-hjerne-barrierefunksjonen, som skiller sentralnervesystemet fra den perifere sirkulasjonen, kan øke risikoen for utbruddet og forverre forløpet av AD.

   Microglia har blitt foreslått å spille en avgjørende rolle i de fleste nevropatologier, ettersom de aktiveres ved påvisning av endringer i hjernens homeostase. Denne celletypen fungerer som fastboende makrofager i hjernen, og skanner hele tiden det lokale mikromiljøet for tegn på infeksjon og skade og blir aktivert når det blir funnet. Som et resultat frigjøres en rekke pro-inflammatoriske mediatorer, inkludert cytokiner, reaktive oksygenarter (ROS) og nitrogenoksid. I kontrast er antioksidantforsvarssystemer, som glutationperoksidase-1 og superoksiddismutase-1, redusert hos AD-pasienter.

   En betydelig del av plasma Aβ er assosiert med triglyseridrike lipoproteiner (TRL) som skilles ut fra hepatocytter og enterocytter. Disse partiklene er preget av apolipoprotein B, som fungerer som en indikator på postprandial dyslipidemi, som er en overdreven, men forbigående økning i TRL etter fettabsorpsjon i kosten og fører til dannelse av aterosklerose. Dette fenomenet kan være sammenhengen mellom hjerte- og karsykdommer og Alzheimers sykdom. Eksistensen av en slik kobling er allerede demonstrert i kliniske og tverrsnittsstudier, men den underliggende mekanismen er fortsatt uklar.

   Det er akkumulerende bevis for at fettinntak i kosten er assosiert med utbruddet og progresjonen av Alzheimers sykdom. Dermed vil inntak av mettet fettsyre (SFA) være en skadelig faktor som fremmer dyslipidemi, endotelial dysfunksjon, betennelse og oksidativt stress. I kontrast er inntak av fett rik på fler- eller enumettede fettsyrer (PUFA og MUFA) assosiert med lavere sykdomsprevalens, sannsynligvis som en konsekvens av lavere nivåer av systemisk betennelse.

   Olivenpresseolje oppnås fra det faste biproduktet fra olivenoljeproduksjonen ved løsningsmiddelekstraksjon eller sentrifugering. Lagringsperioden til dette biproduktet tillater anrikning av oljen med komponentene i fruktskallet og trebladene, av stor interesse på grunn av deres biologiske aktivitet, som bare finnes i spor i virgin olivenolje. Således er sentrifugert olivenpresseolje anriket på komponenter av den uforsåpbare fraksjonen som er fettløselige. Selv om en del av disse forbindelsene går tapt under raffinering, kan de under milde raffineringsforhold beholdes i relevante konsentrasjoner. Disse komponentene inkluderer steroler og tokoferoler, samt triterpensyrene oleanolisk og maslinsyre.

   I tidligere in vitro-studier har etterforskerne vist at de bioaktive forbindelsene i olivenpresseolje alfa-tokoferol, oleanolsyre og beta-sitosterol var i stand til å dempe mikroglial aktivering, både isolert og som en del av kunstige triglyseridrike lipoproteiner (TRL). Mikroglial demping ble bestemt ved å måle ulike markører for betennelse og oksidativt stress, som frigjøres av cellen når de utsettes for stimulering som fører til overaktivering. Dette funnet åpnet for muligheten for at hvis disse bioaktive forbindelsene når hjernen, kan de bidra til å forhindre eller bremse utviklingen av nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom.

   Etterforskerne utførte deretter en sammenlignende postprandial studie for å bestemme om human TRL oppnådd etter inntak av olivenpresseolje var i stand til å dempe mikroglialaktivering i større grad enn de oppnådd etter inntak av solsikkeolje med høyt oljeinnhold. Etterforskerne fant at til visse tider i løpet av den postprandiale perioden var frigjøringen av markører for betennelse og oksidativt stress fra mikrogliaceller behandlet med TRL lavere når de ble avledet fra oljeinntak av olivenpresse. Dermed ble det demonstrert at hos friske forsøkspersoner resulterer inntak av presseresterolje i postprandial perioden i produksjon av lipoproteiner som bærer dets bioaktive forbindelser, og at disse deltar i dempningen av mikroglial aktivering.

   Følgelig mener etterforskerne at tiden er inne for å teste hypotesen vår hos pasienter diagnostisert med Alzheimers sykdom, som presenterer hukommelsesproblemer eller begynnende kognitiv svikt. For dette prosjektet antar etterforskerne at disse pasientene vil ha endringer i postprandial lipidmetabolisme som vil resultere i TRL med større kapasitet til å overaktivere mikroglia, men at inntak av oljerester vil dempe denne aktiveringen. Hvis dette er tilfelle, vil det tyde på at inntak av avfallsolje kan forhindre nevroinflammasjon forårsaket av mikroglia-overaktivering, og redusere risikoen for å utvikle og utvikle Alzheimers sykdom.

2. ARBEIDSHYPOTESE

   Dette prosjektet er basert på demonstrasjonen av at TRL, både kunstig og av menneskelig opprinnelse, er i stand til å fremkalle aktivering av mikroglia, et fenomen assosiert med nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom. I tillegg har forbruket av olivenpresseolje og dens bioaktive forbindelser vist seg å kunne dempe denne aktiveringen. Tilnærmingen til dette forskningsprosjektet er at inntak av olivenpresseolje av Alzheimers-pasienter vil føre til dannelse av postprandial TRL som opprettholder disse bioaktive forbindelsene og dermed beholder deres beskyttende kapasitet mot mikroglial aktivering og betennelse.

   Hvis dette er tilfelle, vil bevisene som er oppnådd legge grunnlaget for utviklingen av nye helseanvendelser av pressolje, som vil være basert på påvirkningen av TRL dannet i postprandial perioden og som kan brukes til forebygging og behandling av Alzheimers. sykdom.

3. MÅL

For å teste hypotesen ovenfor, vil disse spesifikke målene bli adressert:

1. For å bestemme mulige endringer i postprandial lipidmetabolisme hos pasienter med mild eller tidlig stadium diagnostisert Alzheimers sykdom.
2. For å vurdere om inntaket av presseresterolje er i stand til å normalisere disse endringene i postprandial lipidmetabolisme sammenlignet med høyoljesyresolsikkeolje.
3. For å oppnå og karakterisere human TRL oppnådd etter inntak av pressresterolje eller solsikkeolje med høyt oljeinnhold.
4. For å evaluere den dempende effekten av mikroglial aktivering av TRL oppnådd etter inntak av pressresterolje sammenlignet med høyoljesyresolsikkeolje.

4. EKSPERIMENTELL DESIGN OG AKTIVITETER

Studien er designet som en randomisert, dobbeltblind, postprandial crossover-studie på Alzheimerspasienter, som vil deles tilfeldig inn i to grupper og sammenlignes med friske kontroller på samme alder. Alle forsøkspersoner vil motta presseresterolje og en høyoljesyresolsikkeolje.

AKTIVITET 1. Å SKAFFE EN OLJE RIK PÅ BIOAKTIVE FORBINDELSER

Olivenpresseoljen vil bli levert av ORIVA, mens solsikkeoljen med høyt oljeinnhold vil være av kommersiell opprinnelse. Begge oljene vil bli karakterisert ved Instituto de la Grasa-CSIC for å bestemme innholdet i sure og triterpeniske alkoholer, tokoferoler og steroler.

AKTIVITET 2. UTVALG AV FRIVILLIGE OG ADMINISTRASJON AV DE EKSPERIMENTELLE OLJENE

Delaktivitet 2.1. Utvalg av frivillige

Den postprandiale rettssaken vil bli utført i henhold til de grunnleggende prinsippene i Helsingfors-erklæringen, Europarådskonvensjonen og UNESCOs verdenserklæring og vil finne sted på nevrologisk avdeling ved sykehuset Virgen de Valme i Sevilla. Voksne frivillige vil bli valgt ut fra de som har blitt diagnostisert med Alzheimers sykdom, basert på resultatene av kliniske og kognitive tester ved bruk av standardkriterier samt med bruk av spesifikke biomarkører. Inklusjonskriterier vil også inkludere tilstrekkelige syn og hørselsevner og å ha en oppfølging av utviklingen av sykdommen av helsepersonell. Eksklusjonskriterier vil inkludere klinisk signifikante psykiatriske lidelser; systemisk sykdom eller infeksjon som kan påvirke sikkerheten; kardiovaskulær sykdom i løpet av de siste 2 årene; ukontrollert hypertensjon i løpet av de siste 6 månedene; kreft i løpet av de siste 5 årene; narkotika- eller alkoholmisbruk i løpet av de siste 2 årene; og insulinavhengig diabetes.

For deltakelse må enkeltpersoner også gi skriftlig samtykke til en protokoll godkjent av Etikkkomiteen ved Virgen de Valme Hospital, etter å ha blitt informert både muntlig og skriftlig. De vil bli oppfordret til å unngå inntak av alkoholholdige drikkevarer og tobakk i løpet av dagen før rettssakene gjennomføres.

Delaktivitet 2.2. Bestemmelse av prøvestørrelse. Den kvantitative variabelen som skal undersøkes i denne studien er den postprandiale plasmatriglyseridkonsentrasjonen. Forutsatt at triglyseridkonsentrasjonen vil reduseres med minst 10 % som følge av inntak av olivenpresseolje sammenlignet med høyoljesyresolsikkeolje og tatt i betraktning en studiesikkerhet på 95 % (risiko α 0,05; zα 1,645) og en kraft på 90 % (zβ 1,282), oppnås en prøvestørrelse på 16 frivillige. På grunn av mulige frivillige avslag (selv om ingen bivirkninger forventes), anses det som forsvarlig å øke prøvestørrelsen til 20 forsøkspersoner per gruppe.

Delaktivitet 2.3. Administrering av eksperimentelle måltider På prøvedagen, og etter 12 timers faste over natten, vil hver deltaker få tatt en blodprøve ved punktering av cubitalvenen. De vil deretter motta en dose av olivenolje av pressrester eller solsikkeolje med høyt oljeinnhold, som de vil spise som en del av en frokost inkludert kaffe eller melk og toast med grovt brød. Etter inntak vil hver deltaker få tatt blodprøver hver time i en periode på 7 timer etter måltidet. I løpet av denne tiden vil fri tilgang til vanninntak være tillatt.

AKTIVITET 3. ISOLASJON OG KARAKTERISERING AV HUMANE TRIGLYCERID-RIKE LIPOPROTEINER (TRL)

Delaktivitet 3.1. Bestemmelser i blodserum Fra alikvotene av kubitalt blod som er oppnådd, skal serum oppnås ved sentrifugering og NaN3, PMSF og aprotinin skal tilsettes som konserveringsmidler for å unngå proteolytisk nedbrytning. Seraene vil bli lagret ved -80 °C frem til analyse. I blodserum vil triglyseridkonsentrasjon bli bestemt ved spektrofotometri og apolipoprotein B-konsentrasjon ved immunturbidimetri. Disse målingene vil tillate overvåking av utviklingen av postprandial TRL-dannelse og klaring. I tillegg vil serumkonsentrasjoner av oleanolsyre, alfa-tokoferol og beta-sitosterol bli bestemt. Et analytisk ekstraksjons- og fraksjoneringssystem vil bli fulgt ved bruk av GC-MS-metoden utviklet i vårt laboratorium for identifikasjon-kvantifisering av triterpen.

Delaktivitet 3.2. Isolering og karakterisering av triglyseridrike lipoproteiner (TRL) Tilstedeværelsen av oleanolsyre i TRL isolert ved ultrasentrifugering av sera oppnådd i den postprandiale analysen vil bli undersøkt. Innhold av fettsyrer og TG og apo B48 og B100, som markører for tilstedeværelse av chylomikroner og VLDL, vil bli bestemt ved ELISA. De samme partiklene vil bli brukt til mikroglial aktiveringsstudie (Aktivitet 4).

AKTIVITET 4. MIKROGLIAL AKTIVERING I HUMAN TRL-BEHANDLEDE BV-2-CELLER I denne aktiviteten vil musecellelinjen BV-2 bli brukt som en mikroglialcellemodell. Denne celletypen vil bli dyrket i DMEM-medium supplert med 10 % varmeinaktivert FBS, streptomycin (100 mg/ml) og penicillin (100 IE/ml), under 100 % fuktighet og 5 % CO2. Eksperimenter vil bli utført i 5 % FBS-redusert medium. Celler vil bli behandlet med TRL-er oppnådd i den postprandiale analysen. Behandlingene vil bli opprettholdt i 24 timer.

Delaktivitet 4.1. Effekt av human TRL på cellelevedyktighet Først skal cellelevedyktighet måles ved hjelp av MTT-metoden (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium). Etter inkubering i 24 timer skal cellene vaskes med friskt medium supplert med 5 % FBS og behandles med TRL i 12, 24 og 36 timer. Cellene skal vaskes med friskt medium supplert med 5 % FBS og behandles med TRL i 12, 24 og 36 timer. MTT-løsningen skal deretter legges til. Det resulterende formazan-utfellingen vil bli oppløst i DMSO og cellelevedyktighet vil bli kvantifisert ved å måle absorbansen ved 490 nm.

Delaktivitet 4.2. Effekt på ROS-produksjon og redoksaktivitet Den fluorescerende proben 2',7'-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA), som diffunderer over cellemembranen og hydrolyseres av intracellulære esteraser for å danne ikke-fluorescerende DCFH, vil bli brukt til å bestemme intracellulær konsentrasjon av ROS. I nærvær av ROS oksideres DCFH raskt for å danne høyt fluorescerende diklorfluorescein (DCF). Intensiteten til den utsendte fluorescensen (485 nm eksitasjon, 825 nm emisjon) er proporsjonal med den intracellulære konsentrasjonen av ROS.

Total glutation samt oksidert glutation vil bli bestemt ved hjelp av den enzymatiske metoden, basert på den NADPH-avhengige GSSG-reduktaseaktiviteten, som spektrofotometrisk overvåker komplekset som dannes av GSH og ditionitrobenzosyre (DTNB).

Delaktivitet 4.3. Effekt av humane TRL på cytokinproduksjon BV-2-celler vil bli behandlet med postprandiale TRL og produksjonen av pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske cytokiner i kultursupernatanten vil bli bestemt ved bruk av kommersielle ELISA-sett i henhold til produsentens protokoller.

Delaktivitet 4.4. Effekt av humane TRL-er på cytokin-genekspresjon BV-2-celler vil bli behandlet med postprandiale TRL-er og mRNA vil bli isolert. For å bestemme genuttrykket til cytokinene av interesse, vil sanntids PCR-teknikken etter retrotranskripsjon til cDNA bli brukt, ved bruk av primere designet for dette formålet.