Az étkezés utáni gyulladásos folyamatok enyhítése Alzheimer-kórban szenvedő betegeknél törkölyolaj fogyasztása révén (CORDIAL)

1. HÁTTÉR

   Az Alzheimer-kór (AD) a demencia leggyakoribb oka, és prevalenciája 2050-re várhatóan megnégyszereződik. Az Alzheimer-kórt kórosan jelentős neuronveszteség és krónikus gyulladás jellemzi, amely az amiloid-béta-ban (Aβ) és a hiperfoszforilált Tau fehérjében dúsított fehérjelerakódások cerebrovaszkuláris és parenchymális felhalmozódásával jár. A felhalmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy a központi idegrendszert a perifériás keringéstől elválasztó vér-agy gát funkció megzavarása növelheti az AD kialakulásának kockázatát és ronthatja az AD lefolyását.

   A mikrogliákról azt feltételezték, hogy kulcsfontosságú szerepet játszanak a legtöbb neuropatológiában, mivel az agy homeosztázisában bekövetkező változások észlelésekor aktiválódnak. Ez a sejttípus az agyban rezidens makrofágokként működik, folyamatosan pásztázva a helyi mikrokörnyezetet fertőzés és sérülés jelei után, és amikor megtalálják, aktiválódnak. Ennek eredményeként számos gyulladást elősegítő mediátor szabadul fel, beleértve a citokineket, a reaktív oxigénfajtákat (ROS) és a nitrogén-oxidot. Ezzel szemben az antioxidáns védelmi rendszerek, mint például a glutation-peroxidáz-1 és a szuperoxid-diszmutáz-1, csökkentek az AD betegekben.

   A plazma Aβ jelentős része trigliceridben gazdag lipoproteinekhez (TRL) kapcsolódik, amelyek hepatocitákból és enterocitákból választódnak ki. Ezeket a részecskéket az apolipoprotein B jellemzi, amely a posztprandiális diszlipidémia indikátoraként szolgál, ami a TRL túlzott, de átmeneti növekedése az étrendi zsír felszívódása után, és ateroszklerózis kialakulásához vezet. Ez a jelenség lehet az összefüggés a szív- és érrendszeri betegségek és az Alzheimer-kór között. Egy ilyen kapcsolat létezését klinikai és keresztmetszeti vizsgálatok már bizonyították, de a mögöttes mechanizmus továbbra is tisztázatlan.

   Egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy az étrendi zsírbevitel összefüggésbe hozható az Alzheimer-kór kialakulásával és progressziójával. Így a telített zsírsavak (SFA) bevitele káros tényező lenne, elősegítve a dyslipidaemiát, az endothel diszfunkciót, a gyulladást és az oxidatív stresszt. Ezzel szemben a többszörösen vagy egyszeresen telítetlen zsírsavakban (PUFA és MUFA) gazdag zsírok fogyasztása alacsonyabb betegségprevalenciával jár, valószínűleg az alacsonyabb szintű szisztémás gyulladás következményeként.

   Az olívatörkölyolajat az olívaolajgyártás szilárd melléktermékéből nyerik oldószeres extrakcióval vagy centrifugálással. Ennek a mellékterméknek a tárolási ideje lehetővé teszi az olaj feldúsítását a biológiai aktivitásuk miatt nagy érdeklődésre számot tartó gyümölcshéj és falevelek összetevőivel, amelyek a szűz olívaolajban csak nyomokban találhatók meg. Így a centrifugált olívapogácsa-olaj az el nem szappanosítható frakció zsírban oldódó komponenseiben gazdagodik. Bár ezeknek a vegyületeknek egy része elvész a finomítás során, enyhe finomítási körülmények között megfelelő koncentrációban visszatarthatók. Ezek a komponensek közé tartoznak a szterolok és tokoferolok, valamint a triterpénsav, oleanolsav és maszlinsav.

   Korábbi in vitro vizsgálatok során a kutatók kimutatták, hogy az olíva törkölyolajban található bioaktív vegyületek, az alfa-tokoferol, az oleanolsav és a béta-szitoszterol képesek voltak csillapítani a mikroglia aktivációt, mind izoláltan, mind a mesterséges trigliceridben gazdag lipoproteinek (TRL) részeként. A mikroglia attenuációját a gyulladás és az oxidatív stressz különböző markereinek mérésével határozták meg, amelyeket a sejt felszabadít, ha túlzott aktiválódáshoz vezet. Ez a felfedezés megnyitotta a lehetőséget annak lehetőségére, hogy ha ezek a bioaktív vegyületek elérik az agyat, akkor segíthetnek megelőzni vagy lelassítani a neurodegeneratív betegségek, például az Alzheimer-kór kialakulását.

   A kutatók ezután összehasonlító posztprandiális vizsgálatot végeztek annak megállapítására, hogy az olívapogácsa-olaj fogyasztása után kapott humán TRL-ek képesek-e nagyobb mértékben csillapítani a mikroglia aktivációt, mint a magas olajsavtartalmú napraforgóolaj bevitele után. A kutatók azt találták, hogy az étkezés utáni időszakban bizonyos időpontokban a gyulladás és az oxidatív stressz markereinek felszabadulása a TRL-lel kezelt mikrogliasejtekből alacsonyabb volt, ha azok olívamaradék-olaj beviteléből származtak. Így bebizonyosodott, hogy egészséges alanyoknál a törkölyolaj fogyasztása a posztprandiális időszakban a bioaktív vegyületeit hordozó lipoproteinek termelődését eredményezi, és ezek részt vesznek a mikroglia aktiváció csillapításában.

   Következésképpen a kutatók úgy vélik, hogy eljött az idő hipotézisünk tesztelésére olyan Alzheimer-kórral diagnosztizált betegeken, akiknél memóriaproblémák vagy kezdődő kognitív károsodások jelentkeznek. Ebben a projektben a kutatók azt feltételezik, hogy ezeknek a betegeknek az étkezés utáni lipidmetabolizmusában megváltoznak, ami azt eredményezi, hogy a TRL nagyobb mértékben képes túlaktiválni a mikrogliát, de a törkölyolaj bevitele gyengíti ezt az aktivációt. Ha ez a helyzet, ez azt sugallja, hogy a törkölyolaj fogyasztása megelőzheti a mikroglia túlaktiválódása által okozott ideggyulladást, csökkentve az Alzheimer-kór kialakulásának és előrehaladásának kockázatát.

2. MŰKÖDÉSI HIPOTÉZIS

   Ez a projekt azon a demonstráción alapul, hogy a mesterséges és emberi eredetű TRL-ek képesek a mikroglia aktiválódását kiváltani, amely jelenség olyan neurodegeneratív betegségekhez kapcsolódik, mint az Alzheimer-kór. Ezenkívül az olíva törkölyolaj és bioaktív vegyületeinek fogyasztása képes csökkenteni ezt az aktiválást. Ennek a kutatási projektnek az a megközelítése, hogy az olíva törkölyolaj fogyasztása az Alzheimer-kóros betegek által az étkezés utáni TRL kialakulásához vezet, amely fenntartja ezeket a bioaktív vegyületeket, és így megőrzi védőképességüket a mikroglia aktivációval és gyulladással szemben.

   Ha ez a helyzet, a megszerzett bizonyítékok lefektetnék az alapjait a törkölyolaj új egészségügyi alkalmazásainak kifejlesztésének, amelyek a posztprandiális időszakban kialakult TRL hatásán alapulnának, és amelyek felhasználhatók az Alzheimer-kór megelőzésére és kezelésére. betegség.

3. CÉLKITŰZÉSEK

A fenti hipotézis teszteléséhez a következő konkrét célokat kell megcélozni:

1. Enyhe vagy korai stádiumban diagnosztizált Alzheimer-kórban szenvedő betegek posztprandiális lipidanyagcseréjének lehetséges változásainak meghatározása.
2. Annak felmérése, hogy a törkölyolaj fogyasztása képes-e normalizálni ezeket a posztprandiális lipidanyagcsere-változásokat a magas olajsavtartalmú napraforgóolajhoz képest.
3. Törkölyolaj vagy magas olajsavtartalmú napraforgóolaj elfogyasztása után kapott humán TRL előállítása és jellemzése.
4. A törkölyolaj elfogyasztása után kapott TRL mikroglia aktiválásának gyengítő hatásának értékelése a magas olajsavtartalmú napraforgóolajjal összehasonlítva.

4. KÍSÉRLETI TERVEZÉS ÉS TEVÉKENYSÉGEK

A vizsgálatot randomizált, kettős-vak, étkezés utáni keresztezési vizsgálatként tervezték Alzheimer-kóros betegeken, akiket véletlenszerűen két csoportra osztanak, és összehasonlítják őket azonos korú egészséges kontrollokkal. Minden alany törkölyolajat és magas olajsavtartalmú napraforgóolajat kap.

TEVÉKENYSÉG 1. BIOKATÍV VEGYÜLETEKBEN GAZDAG TÖRÖKÖLAJ BESZERZÉSE

Az olíva törkölyolajat az ORIVA biztosítja, míg a magas olajsavtartalmú napraforgóolaj kereskedelmi eredetű lesz. Mindkét olajat az Instituto de la Grasa-CSIC jellemzi, hogy meghatározzák a sav- és triterpénalkoholok, tokoferolok és szterolok tartalmát.

2. TEVÉKENYSÉG ÖNKÉNTESEK KIVÁLASZTÁSA ÉS A KÍSÉRLETI OLAJOK BEADÁSA

2.1. résztevékenység. Önkéntesek kiválasztása

Az étkezés utáni vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozat, az Európa Tanács Egyezménye és az UNESCO Egyetemes Nyilatkozat alapelvei szerint hajtják végre, és a sevillai Virgen de Valme Kórház Neurológiai Osztályán kerül sor. A felnőtt önkénteseket az Alzheimer-kórral diagnosztizáltak közül választják ki, standard kritériumokat alkalmazó klinikai és kognitív tesztek eredményei, valamint specifikus biomarkerek használatával. A felvételi kritériumok közé tartozik a megfelelő látási és hallási képesség, valamint a betegség fejlődésének nyomon követése az egészségügyi személyzet által. A kizárási kritériumok közé tartoznak a klinikailag jelentős pszichiátriai rendellenességek; szisztémás betegség vagy fertőzés, amely befolyásolhatja a biztonságot; szív- és érrendszeri betegségek az elmúlt 2 évben; nem kontrollált magas vérnyomás az elmúlt 6 hónapban; rák az elmúlt 5 évben; kábítószerrel vagy alkohollal való visszaélés az elmúlt 2 évben; és inzulinfüggő cukorbetegség.

A részvételhez az egyéneknek írásbeli hozzájárulásukat kell adniuk a Virgen de Valme Kórház Etikai Bizottsága által jóváhagyott protokollhoz, miután szóban és írásban is tájékoztatták őket. Arra biztatják őket, hogy a perek lefolytatását megelőző napon kerüljék az alkoholos italok és a dohányzás fogyasztását.

résztevékenység 2.2. A minta méretének meghatározása. A tanulmányban vizsgálandó mennyiségi változó az étkezés utáni plazma trigliceridkoncentrációja. Feltéve, hogy a trigliceridkoncentráció legalább 10 %-kal csökken az olívapogácsa-olaj fogyasztása következtében a magas olajsavtartalmú napraforgóolajhoz képest, és figyelembe véve a 95 %-os vizsgálati biztonságot (kockázat α 0,05; zα 1,645) és 90 %-os teljesítményt (zβ 1,282), 16 önkéntesből álló mintát kapunk. Az esetleges önkéntes visszautasítások miatt (bár nem várható káros hatás), ésszerűnek tartják a minta méretét csoportonként 20 alanyra növelni.

2.3. résztevékenység. Kísérleti étkezések beadása A vizsgálat napján és 12 órás éjszakai koplalás után minden résztvevőtől vérmintát vesznek a cubitalis véna punkciójával. Ezután kapnak egy adag törköly olívaolajat vagy magas olajsav tartalmú napraforgóolajat, amelyet egy kávét vagy tejet és pirítóst tartalmazó reggeli részeként fogyasztanak el teljes kiőrlésű kenyérrel. A lenyelést követően minden résztvevő vérből aliquot részt vesz minden órában az étkezés utáni 7 órán keresztül. Ez idő alatt ingyenes hozzáférést biztosítanak a vízvételhez.

3. TEVÉKENYSÉG. A HUMÁN TRIGLICERIDBEN DÚS LIPOPROTEINEK (TRL) IZOLÁLÁSA ÉS JELLEMZÉSE

3.1. résztevékenység. Meghatározások vérszérumban A kapott kubitális vér alikvotjaiból centrifugálással szérumot kell nyerni, és tartósítószerként NaN3-at, PMSF-et és aprotinint kell hozzáadni a proteolitikus lebomlás elkerülése érdekében. A szérumokat -80 °C-on tároljuk az elemzésig. A vérszérumban a triglicerid-koncentrációt spektrofotometriával, az apolipoprotein B-koncentrációt pedig immunturbidimetriával kell meghatározni. Ezek a mérések lehetővé teszik az étkezés utáni TRL kialakulásának és kiürülésének nyomon követését. Ezenkívül meg kell határozni az oleanolsav, az alfa-tokoferol és a béta-szitoszterol szérumkoncentrációját. A triterpén azonosítására-mennyiségi meghatározására laboratóriumunkban kifejlesztett GC-MS módszerrel analitikai extrakciós és frakcionálási rendszert követünk.

résztevékenység 3.2. Trigliceridben gazdag lipoproteinek (TRL) izolálása és jellemzése Megvizsgálják az oleanolsav jelenlétét a posztprandiális vizsgálat során kapott szérumok ultracentrifugálásával izolált TRL-ben. A zsírsav- és TG-tartalmat, valamint az apo B48-at és B100-at, mint a kilomikronok és a VLDL jelenlétének markereit, ELISA-val kell meghatározni. Ugyanezeket a részecskéket használjuk fel a mikroglia aktiválási vizsgálatához (4. tevékenység).

4. TEVÉKENYSÉG. MIKROGLIÁLIS AKTIVÁLÁS HUMÁN TRL-lel KEZELT BV-2 SEJTEKBEN Ebben a tevékenységben a BV-2 egérsejtvonalat használjuk mikroglia sejtmodellként. Ezt a sejttípust 10% hővel inaktivált FBS-sel, sztreptomicinnel (100 mg/ml) és penicillinnel (100 NE/ml) kiegészített DMEM tápközegben tenyésztjük 100% páratartalom és 5% CO2 mellett. A kísérleteket 5% FBS csökkentett tápközegben hajtjuk végre. A sejteket az étkezés utáni vizsgálat során kapott TRL-ekkel kezeljük. A kezeléseket 24 órán át folytatják.

4.1. résztevékenység. A humán TRL hatása a sejtek életképességére Először is a sejtek életképességét az MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium) módszerrel kell mérni. 24 órás inkubáció után a sejteket 5% FBS-sel kiegészített friss tápközeggel mossuk, és TRL-lel kezeljük 12, 24 és 36 órán keresztül. A sejteket 5% FBS-sel kiegészített friss tápközeggel kell mosni, és 12, 24 és 36 órán át TRL-lel kell kezelni. Ezután hozzáadjuk az MTT-oldatot. A kapott formazán csapadékot feloldjuk DMSO-ban, és a sejtek életképességét az abszorbancia mérésével 490 nm-en számszerűsítjük.

4.2. résztevékenység. A ROS-termelésre és a redoxaktivitásra gyakorolt ​​hatás A sejtmembránon átdiffundáló 2',7'-diklór-fluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) fluoreszcens szondát használjuk, amelyet intracelluláris észterázok hidrolizálnak, hogy nem fluoreszcens DCFH-t képezzenek. A ROS intracelluláris koncentrációja. ROS jelenlétében a DCFH gyorsan oxidálódik, és erősen fluoreszcens diklórfluoreszceint (DCF) képez. A kibocsátott fluoreszcencia intenzitása (485 nm gerjesztés, 825 nm emisszió) arányos a ROS intracelluláris koncentrációjával.

A teljes glutation, valamint az oxidált glutation meghatározása enzimatikus módszerrel történik, amely a NADPH-függő GSSG reduktáz aktivitáson alapul, amely spektrofotometriásan monitorozza a GSH és a ditionitrobenzoesav (DTNB) alkotta komplexet.

4.3. résztevékenység. A humán TRL-ek hatása a citokintermelésre A BV-2 sejteket étkezés utáni TRL-ekkel kezeljük, és a tenyészet felülúszójában a gyulladást elősegítő és gyulladásgátló citokinek termelődését kereskedelmi ELISA kitekkel határozzuk meg a gyártó protokollja szerint.

4.4. résztevékenység. A humán TRL-ek hatása a citokin génexpresszióra A BV-2 sejteket étkezés utáni TRL-ekkel kezeljük, és mRNS-t izolálunk. A kérdéses citokinek génexpressziójának meghatározásához a cDNS-re történő retrotranszkripciót követő valós idejű PCR technikát alkalmazzuk, erre a célra tervezett primerek felhasználásával.