Útlum postprandiálních zánětlivých procesů u pacientů s Alzheimerovou chorobou konzumací oleje z pokrutin (CORDIAL)

1. POZADÍ

   Alzheimerova choroba (AD) je nejčastější příčinou demence a očekává se, že její prevalence se do roku 2050 zčtyřnásobí. Alzheimerova choroba je patologicky charakterizována podstatnou ztrátou neuronů a chronickým zánětem, který je spojen s cerebrovaskulární a parenchymální akumulací proteinových depozit obohacených o amyloid-beta (Ap) a hyperfosforylovaný protein Tau. Hromadné důkazy naznačují, že narušení funkce hematoencefalické bariéry, která odděluje centrální nervový systém od periferního oběhu, může zvýšit riziko vzniku a zhoršit průběh AD.

   Bylo navrženo, že mikroglie hrají klíčovou roli ve většině neuropatologií, protože jsou aktivovány při detekci změn v homeostáze mozku. Tento typ buněk se chová jako rezidentní makrofágy v mozku, neustále skenuje místní mikroprostředí a hledá známky infekce a poranění a aktivuje se, když je nalezen. V důsledku toho se uvolňuje řada prozánětlivých mediátorů, včetně cytokinů, reaktivních forem kyslíku (ROS) a oxidu dusnatého. Naproti tomu antioxidační obranné systémy, jako je glutathionperoxidáza-1 a superoxiddismutáza-1, jsou u pacientů s AD sníženy.

   Významná část plazmatického Ap je spojena s lipoproteiny bohatými na triglyceridy (TRL), které jsou vylučovány z hepatocytů a enterocytů. Tyto částice jsou charakterizovány apolipoproteinem B, který slouží jako indikátor postprandiální dyslipidémie, což je přehnané, ale přechodné zvýšení TRL po absorpci tuků z potravy a vede ke vzniku aterosklerózy. Tento jev by mohl být spojnicí mezi kardiovaskulárním onemocněním a Alzheimerovou chorobou. Existence takového spojení již byla prokázána v klinických a průřezových studiích, ale základní mechanismus zůstává nejasný.

   Hromadí se důkazy, že příjem tuků ve stravě je spojen se vznikem a progresí Alzheimerovy choroby. Příjem nasycených mastných kyselin (SFA) by tedy byl škodlivým faktorem podporujícím dyslipidémii, endoteliální dysfunkci, zánět a oxidační stres. Naproti tomu konzumace tuků bohatých na poly- nebo mononenasycené mastné kyseliny (PUFA a MUFA) je spojena s nižší prevalencí onemocnění, pravděpodobně v důsledku nižších úrovní systémového zánětu.

   Olivový olej z pokrutin se získává z pevného vedlejšího produktu výroby olivového oleje extrakcí rozpouštědlem nebo odstředěním. Doba skladování tohoto vedlejšího produktu umožňuje obohacení oleje o složky ovocné kůry a listů stromů, které jsou velmi zajímavé pro jejich biologickou aktivitu, které se v panenském olivovém oleji nacházejí pouze ve stopách. Odstředěný olej z olivových pokrutin je tedy obohacen o složky nezmýdelnitelné frakce, které jsou rozpustné v tucích. Přestože se část těchto sloučenin během rafinace ztratí, za mírných podmínek rafinace mohou být zachovány v příslušných koncentracích. Tyto složky zahrnují steroly a tokoferoly, stejně jako triterpenové kyseliny oleanolová a mastlinová.

   V předchozích studiích in vitro výzkumníci prokázali, že bioaktivní sloučeniny v oleji z olivových pokrutin alfa-tokoferol, kyselina oleanolová a beta-sitosterol byly schopny ztlumit mikrogliální aktivaci, a to jak izolovaně, tak jako součást umělých lipoproteinů bohatých na triglyceridy (TRL). Mikrogliální atenuace byla stanovena měřením různých markerů zánětu a oxidačního stresu, které jsou uvolňovány buňkou, když jsou vystaveny stimulaci, která vede k nadměrné aktivaci. Toto zjištění otevřelo dveře možnosti, že pokud se tyto bioaktivní sloučeniny dostanou do mozku, mohou pomoci předcházet nebo zpomalit rozvoj neurodegenerativních onemocnění, jako je Alzheimerova choroba.

   Vyšetřovatelé poté provedli srovnávací postprandiální studii, aby zjistili, zda lidské TRL získané po příjmu oleje z olivových pokrutin byly schopny zmírnit mikrogliální aktivaci ve větší míře než ty, které byly získány po příjmu slunečnicového oleje s vysokým obsahem kyseliny olejové. Výzkumníci zjistili, že v určitých obdobích během postprandiálního období bylo uvolňování markerů zánětu a oxidačního stresu mikrogliálními buňkami ošetřenými TRL nižší, když byly odvozeny z příjmu olivového oleje z pokrutin. Bylo tedy prokázáno, že u zdravých jedinců má konzumace oleje z pokrutin během postprandiálního období za následek produkci lipoproteinů nesoucích jeho bioaktivní sloučeniny a že se podílejí na zeslabení mikrogliální aktivace.

   V důsledku toho se vyšetřovatelé domnívají, že nastal čas otestovat naši hypotézu u pacientů s diagnózou Alzheimerovy choroby, kteří mají problémy s pamětí nebo počínající kognitivní poruchy. Pro tento projekt vědci předpokládají, že tito pacienti budou mít změny v postprandiálním metabolismu lipidů, které povedou k TRL s větší schopností nadměrně aktivovat mikroglie, ale že příjem oleje z pokrutin tuto aktivaci ztlumí. Pokud je tomu tak, naznačovalo by to, že příjem oleje z pokrutin může zabránit neurozánětu způsobenému nadměrnou aktivací mikroglií, čímž se sníží riziko rozvoje a progrese Alzheimerovy choroby.

2. PRACOVNÍ HYPOTÉZA

   Tento projekt je založen na demonstraci, že TRL, umělé i lidského původu, jsou schopny vyvolat aktivaci mikroglií, což je fenomén spojený s neurodegenerativními onemocněními, jako je Alzheimerova choroba. Kromě toho se ukázalo, že konzumace olivového oleje z pokrutin a jeho bioaktivních sloučenin dokáže tuto aktivaci zmírnit. Přístup tohoto výzkumného projektu spočívá v tom, že konzumace olivového oleje z pokrutin pacienty s alzheimerem povede k tvorbě postprandiálních TRL, které udržují tyto bioaktivní sloučeniny a tím si zachovávají svou ochrannou kapacitu proti aktivaci mikroglií a zánětu.

   Pokud by tomu tak bylo, získané důkazy by položily základy pro vývoj nových zdravotních aplikací pokrutinového oleje, které by byly založeny na vlivu TRL vytvořeného v postprandiálním období a které by bylo možné použít pro prevenci a léčbu Alzheimerovy choroby. choroba.

3. CÍLE

Pro ověření výše uvedené hypotézy budou řešeny tyto konkrétní cíle:

1. Zjistit možné změny v postprandiálním metabolismu lipidů u pacientů s diagnostikovanou Alzheimerovou chorobou v mírném nebo časném stádiu.
2. Posoudit, zda příjem oleje z pokrutin je schopen normalizovat tyto změny v postprandiálním metabolismu lipidů ve srovnání se slunečnicovým olejem s vysokým obsahem kyseliny olejové.
3. Získat a charakterizovat lidský TRL získaný po požití oleje z pokrutin nebo slunečnicového oleje s vysokým obsahem kyseliny olejové.
4. Vyhodnotit zeslabující účinek mikrogliální aktivace pomocí TRL získaného po požití oleje z pokrutin ve srovnání se slunečnicovým olejem s vysokým obsahem kyseliny olejové.

4. EXPERIMENTÁLNÍ DESIGN A AKTIVITY

Studie je navržena jako randomizovaná, dvojitě zaslepená, postprandiální zkřížená studie u pacientů s Alzheimerovou chorobou, kteří budou náhodně rozděleni do dvou skupin a budou porovnáni se zdravými kontrolami stejného věku. Všechny subjekty obdrží olej z pokrutin a slunečnicový olej s vysokým obsahem kyseliny olejové.

AKTIVITA 1. ZÍSKÁNÍ OLEJE Z POKRUBOVÉHO OLEJE BOHATÉHO NA BIOAKTIVNÍ SLOUČENINY

Olivový olej z pokrutin poskytne ORIVA, slunečnicový olej s vysokým obsahem kyseliny olejové bude komerčního původu. Oba oleje budou charakterizovány v Instituto de la Grasa-CSIC za účelem stanovení jejich obsahu v kyselých a triterpenových alkoholech, tokoferolech a sterolech.

AKTIVITA 2. VÝBĚR DOBROVOLNÍKŮ A SPRÁVA EXPERIMENTÁLNÍCH OLEJŮ

Dílčí aktivita 2.1. Výběr dobrovolníků

Postprandiální hodnocení bude probíhat podle základních principů Helsinské deklarace, Úmluvy Rady Evropy a Všeobecné deklarace UNESCO a bude probíhat na neurologickém oddělení nemocnice Virgen de Valme v Seville. Dospělí dobrovolníci budou vybráni z těch, u kterých byla diagnostikována Alzheimerova choroba, na základě výsledků klinických a kognitivních testů za použití standardních kritérií a také za použití specifických biomarkerů. Kritéria pro zařazení budou také zahrnovat přiměřené zrakové a sluchové schopnosti a mít následný záznam o vývoji onemocnění zdravotnickým personálem. Kritéria vyloučení budou zahrnovat klinicky významné psychiatrické poruchy; systémové onemocnění nebo infekce, které by mohly ovlivnit bezpečnost; kardiovaskulární onemocnění během posledních 2 let; nekontrolovaná hypertenze během posledních 6 měsíců; rakovina během posledních 5 let; zneužívání drog nebo alkoholu během posledních 2 let; a diabetes závislý na inzulínu.

Pro účast jsou jednotlivci rovněž povinni dát písemný souhlas s protokolem schváleným etickou komisí nemocnice Virgen de Valme poté, co byli informováni ústně i písemně. Budou vyzváni, aby se vyhnuli konzumaci alkoholických nápojů a tabáku během dne před provedením soudního řízení.

Dílčí aktivita 2.2. Stanovení velikosti vzorku. Kvantitativní proměnnou, která má být v této studii zkoumána, je postprandiální koncentrace triglyceridů v plazmě. Za předpokladu, že koncentrace triglyceridů bude snížena alespoň o 10 % v důsledku příjmu olivového oleje z pokrutin ve srovnání se slunečnicovým olejem s vysokým obsahem kyseliny olejové a s ohledem na bezpečnost studie 95 % (riziko α 0,05; zα 1,645) a sílu 90 % (zp 1,282), je získán vzorek o velikosti 16 dobrovolníků. Vzhledem k možnému odmítnutí dobrovolníků (ačkoli se neočekávají žádné nepříznivé účinky) se považuje za rozumné zvýšit velikost vzorku na 20 subjektů na skupinu.

Dílčí aktivita 2.3. Podávání experimentálních jídel V den pokusu a po 12 hodinách celonočního hladovění bude každému účastníkovi odebrán vzorek krve punkcí kubitální žíly. Poté dostanou dávku olivového oleje z pokrutin nebo slunečnicového oleje s vysokým obsahem kyseliny olejové, které si dají v rámci snídaně včetně kávy nebo mléka a toustu s celozrnným pečivem. Po požití budou každému účastníkovi odebírány alikvoty krve každou hodinu po dobu 7 hodin po jídle. Během této doby bude umožněn volný přístup k odběru vody.

AKTIVITA 3. IZOLACE A CHARAKTERIZACE LIDSKÝCH LIPOPROTEINŮ BOHATÝCH NA TRIGLYCERID (TRL)

Dílčí aktivita 3.1. Stanovení v krevním séru Ze získaných alikvotů kubitální krve se získá sérum centrifugací a přidá se NaN3, PMSF a aprotinin jako konzervační látky, aby se zabránilo proteolytické degradaci. Séra budou až do analýzy skladována při -80 °C. V krevním séru bude koncentrace triglyceridů stanovena spektrofotometrií a koncentrace apolipoproteinu B imunoturbidimetrie. Tato měření umožní sledování vývoje postprandiální tvorby a clearance TRL. Kromě toho budou stanoveny sérové ​​koncentrace kyseliny oleanolové, alfa-tokoferolu a beta-sitosterolu. Bude následovat analytický extrakční a frakcionační systém využívající metodu GC-MS vyvinutou v naší laboratoři pro identifikaci-kvantifikaci triterpenu.

Dílčí aktivita 3.2. Izolace a charakterizace lipoproteinů bohatých na triglyceridy (TRL) Bude zkoumána přítomnost kyseliny oleanolové v TRL izolovaném ultracentrifugací sér získaných v postprandiálním testu. Obsah mastných kyselin a TG a apo B48 a B100, jako markery přítomnosti chylomikronů a VLDL, budou stanoveny pomocí ELISA. Tyto stejné částice budou použity pro studii mikrogliální aktivace (aktivita 4).

AKTIVITA 4. MIKROGLIÁLNÍ AKTIVACE V LIDSKÝCH BUŇKÁCH BV-2 ošetřených TRL V této aktivitě bude jako model mikrogliálních buněk použita myší buněčná linie BV-2. Tento typ buněk bude kultivován v médiu DMEM doplněném 10% teplem inaktivovaným FBS, streptomycinem (100 mg/ml) a penicilinem (100 IU/ml), při 100% vlhkosti a 5% CO2. Experimenty budou prováděny v 5% FBS redukovaném médiu. Buňky budou ošetřeny TRL získanými v postprandiálním testu. Ošetření bude probíhat 24 hodin.

Dílčí aktivita 4.1. Vliv lidského TRL na životaschopnost buněk Nejprve se změří životaschopnost buněk metodou MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium). Po inkubaci po dobu 24 hodin se buňky promyjí čerstvým médiem doplněným 5% FBS a působí se na ně TRL po dobu 12, 24 a 36 hodin. Buňky se promyjí čerstvým médiem doplněným 5% FBS a působí se na ně TRL po dobu 12, 24 a 36 hodin. Poté se přidá roztok MTT. Výsledná sraženina formazanu bude rozpuštěna v DMSO a životaschopnost buněk bude kvantifikována měřením absorbance při 490 nm.

Dílčí aktivita 4.2. Vliv na produkci ROS a redoxní aktivitu Fluorescenční sonda 2',7'-dichlorfluorescein-diacetát (DCFH-DA), která difunduje přes buněčnou membránu a je hydrolyzována intracelulárními esterázami za vzniku nefluorescenčního DCFH, bude použita ke stanovení intracelulární koncentrace ROS. V přítomnosti ROS se DCFH rychle oxiduje za vzniku vysoce fluorescenčního dichlorfluoresceinu (DCF). Intenzita emitované fluorescence (485 nm excitace, 825 nm emise) je úměrná intracelulární koncentraci ROS.

Celkový glutathion i oxidovaný glutathion bude stanoven enzymatickou metodou založenou na NADPH-dependentní GSSG reduktázové aktivitě, která spektrofotometricky sleduje komplex tvořený GSH a kyselinou dithionitrobenzoovou (DTNB).

Dílčí aktivita 4.3. Vliv lidských TRL na produkci cytokinů Buňky BV-2 budou ošetřeny postprandiálními TRL a produkce prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů v kultivačním supernatantu bude stanovena pomocí komerčních souprav ELISA podle protokolů výrobce.

Dílčí aktivita 4.4. Vliv lidských TRL na expresi cytokinového genu Buňky BV-2 budou ošetřeny postprandiálními TRL a bude izolována mRNA. Ke stanovení genové exprese sledovaných cytokinů bude použita technika real-time PCR po retrotranskripci na cDNA s použitím primerů určených pro tento účel.