Atténuation des processus inflammatoires postprandiaux chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer par la consommation d'huile de grignons (CORDIAL)

1. ARRIÈRE-PLAN

   La maladie d'Alzheimer (MA) est la cause la plus fréquente de démence et sa prévalence devrait quadrupler d'ici 2050. La maladie d'Alzheimer se caractérise pathologiquement par une perte neuronale importante et une inflammation chronique, associées à une accumulation cérébrovasculaire et parenchymateuse de dépôts protéiques enrichis en bêta-amyloïde (Aβ) et en protéine Tau hyperphosphorylée. De plus en plus de preuves suggèrent que la perturbation de la fonction de la barrière hémato-encéphalique, qui sépare le système nerveux central de la circulation périphérique, peut augmenter le risque d'apparition et aggraver l'évolution de la MA.

   Il a été proposé que les microglies jouent un rôle crucial dans la plupart des neuropathologies, car elles sont activées lors de la détection d'altérations de l'homéostasie cérébrale. Ce type de cellule agit comme des macrophages résidents dans le cerveau, analysant constamment le microenvironnement local à la recherche de signes d'infection et de blessure et s'activant lorsqu'il est détecté. En conséquence, une multitude de médiateurs pro-inflammatoires sont libérés, notamment des cytokines, des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de l’oxyde nitrique. En revanche, les systèmes de défense antioxydants, tels que la glutathion peroxydase-1 et la superoxyde dismutase-1, sont diminués chez les patients atteints de MA.

   Une partie importante de l'Aβ plasmatique est associée aux lipoprotéines riches en triglycérides (TRL) sécrétées par les hépatocytes et les entérocytes. Ces particules sont caractérisées par l'apolipoprotéine B, qui sert d'indicateur de dyslipidémie postprandiale, qui est une augmentation exagérée mais transitoire du TRL après absorption des graisses alimentaires et conduit à la formation d'athérosclérose. Ce phénomène pourrait être le lien entre les maladies cardiovasculaires et la maladie d'Alzheimer. L’existence d’un tel lien a déjà été démontrée dans des études cliniques et transversales, mais le mécanisme sous-jacent reste flou.

   Il existe de plus en plus de preuves selon lesquelles la consommation de graisses alimentaires est associée à l'apparition et à la progression de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, l’apport en acides gras saturés (AGS) serait un facteur délétère, favorisant la dyslipidémie, le dysfonctionnement endothélial, l’inflammation et le stress oxydatif. En revanche, la consommation de graisses riches en acides gras poly- ou monoinsaturés (AGPI et AGMI) est associée à une prévalence plus faible de la maladie, probablement en raison de niveaux plus faibles d'inflammation systémique.

   L'huile de grignons d'olive est obtenue à partir du sous-produit solide de la production d'huile d'olive par extraction au solvant ou par centrifugation. La durée de conservation de ce sous-produit permet d'enrichir l'huile avec les composants de l'écorce du fruit et des feuilles de l'arbre, d'un grand intérêt en raison de leur activité biologique, qui ne se trouvent qu'à l'état de traces dans l'huile d'olive vierge. Ainsi, l'huile de grignons d'olive centrifugée est enrichie en composants de la fraction insaponifiable qui sont liposolubles. Bien qu'une partie de ces composés soit perdue lors du raffinage, dans des conditions de raffinage douces, ils peuvent être retenus à des concentrations pertinentes. Ces composants comprennent les stérols et les tocophérols, ainsi que les acides triterpéniques oléanolique et maslinique.

   Dans des études in vitro précédentes, les enquêteurs ont démontré que les composés bioactifs de l'alpha-tocophérol, de l'acide oléanolique et du bêta-sitostérol de l'huile de grignons d'olive étaient capables d'atténuer l'activation microgliale, à la fois isolément et dans le cadre de lipoprotéines artificielles riches en triglycérides (TRL). L'atténuation microgliale a été déterminée en mesurant divers marqueurs de l'inflammation et du stress oxydatif, qui sont libérés par la cellule lorsqu'elle est soumise à une stimulation conduisant à une suractivation. Cette découverte ouvre la porte à la possibilité que, si ces composés bioactifs atteignent le cerveau, ils pourraient aider à prévenir ou à ralentir le développement de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer.

   Les enquêteurs ont ensuite mené une étude postprandiale comparative pour déterminer si les TRL humaines obtenues après la consommation d'huile de grignons d'olive étaient capables d'atténuer l'activation microgliale dans une plus grande mesure que celles obtenues après la consommation d'huile de tournesol à haute teneur en acide oléique. Les enquêteurs ont constaté qu'à certains moments de la période postprandiale, la libération de marqueurs d'inflammation et de stress oxydatif par les cellules microgliales traitées avec TRL était plus faible lorsqu'elles provenaient de la consommation d'huile de grignons d'olive. Ainsi, il a été démontré que chez des sujets sains, la consommation d'huile de grignons pendant la période postprandiale entraîne la production de lipoprotéines portant ses composés bioactifs et que celles-ci participent à l'atténuation de l'activation microgliale.

   Par conséquent, les enquêteurs estiment que le moment est venu de tester notre hypothèse chez des patients diagnostiqués avec la maladie d'Alzheimer, qui présentent des problèmes de mémoire ou un début de déficience cognitive. Pour ce projet, les enquêteurs émettent l'hypothèse que ces patients présenteront des altérations du métabolisme lipidique postprandial qui se traduira par un TRL avec une plus grande capacité à suractiver les microglies mais que la prise d'huile de grignons atténuera cette activation. Si tel est le cas, cela suggère que la consommation d'huile de grignons pourrait prévenir la neuroinflammation causée par la suractivation des microglies, réduisant ainsi le risque de développer et de progresser la maladie d'Alzheimer.

2. HYPOTHÈSE DE TRAVAIL

   Ce projet repose sur la démonstration que les TRL, qu'elles soient artificielles ou d'origine humaine, sont capables de provoquer l'activation des microglies, un phénomène associé aux maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. De plus, il a été démontré que la consommation d’huile de grignons d’olive et de ses composés bioactifs est capable d’atténuer cette activation. L'approche de ce projet de recherche est que la consommation d'huile de grignons d'olive par les patients atteints d'Alzheimer conduira à la formation de TRL postprandiale qui maintiennent ces composés bioactifs et conservent ainsi leur capacité protectrice contre l'activation microgliale et l'inflammation.

   Si tel est le cas, les preuves obtenues jetteraient les bases du développement de nouvelles applications sanitaires de l'huile de grignons, qui s'appuieraient sur l'influence des TRL formés dans la période postprandiale et qui pourraient être utilisées pour la prévention et le traitement de la maladie d'Alzheimer. maladie.

3. OBJECTIFS

Pour tester l’hypothèse ci-dessus, ces objectifs spécifiques seront abordés :

1. Déterminer les altérations possibles du métabolisme lipidique postprandial chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer légère ou diagnostiquée à un stade précoce.
2. Évaluer si la consommation d'huile de grignons est capable de normaliser ces altérations du métabolisme lipidique postprandial par rapport à l'huile de tournesol à haute teneur en acide oléique.
3. Obtenir et caractériser le TRL humain obtenu après l'ingestion d'huile de grignons ou d'huile de tournesol à haute teneur en acide oléique.
4. Évaluer l'effet atténuant de l'activation microgliale par TRL obtenu après ingestion d'huile de grignons par rapport à l'huile de tournesol à haute teneur en acide oléique.

4. CONCEPTION EXPÉRIMENTALE ET ACTIVITÉS

L'étude est conçue comme un essai croisé postprandial, randomisé, en double aveugle, chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer, qui seront divisés au hasard en deux groupes et seront comparés à des témoins sains du même âge. Tous les sujets recevront de l'huile de grignons et une huile de tournesol à haute teneur en acide oléique.

ACTIVITÉ 1. OBTENTION D'UNE HUILE DE GRIGNONS RICHE EN COMPOSÉS BIOACTIFS

L'huile de grignons d'olive sera fournie par ORIVA, tandis que l'huile de tournesol à haute teneur en acide oléique sera d'origine commerciale. Les deux huiles seront caractérisées à l'Instituto de la Grasa-CSIC pour déterminer leur teneur en alcools acides et triterpéniques, tocophérols et stérols.

ACTIVITÉ 2. SÉLECTION DES VOLONTAIRES ET ADMINISTRATION DES HUILES EXPÉRIMENTALES

Sous-activité 2.1. Sélection des bénévoles

L'essai postprandial sera réalisé selon les principes fondamentaux de la Déclaration d'Helsinki, de la Convention du Conseil de l'Europe et de la Déclaration universelle de l'UNESCO et aura lieu dans le service de neurologie de l'hôpital Virgen de Valme de Séville. Les volontaires adultes seront sélectionnés parmi ceux qui ont reçu un diagnostic de maladie d'Alzheimer, sur la base des résultats de tests cliniques et cognitifs utilisant des critères standards ainsi qu'avec l'utilisation de biomarqueurs spécifiques. Les critères d'inclusion incluront également des capacités visuelles et auditives adéquates et avoir un suivi de l'évolution de la maladie par le personnel de santé. Les critères d'exclusion incluront les troubles psychiatriques cliniquement significatifs ; maladie ou infection systémique pouvant affecter la sécurité ; maladie cardiovasculaire au cours des 2 dernières années ; hypertension incontrôlée au cours des 6 derniers mois ; cancer au cours des 5 dernières années ; abus de drogues ou d'alcool au cours des 2 dernières années ; et le diabète insulino-dépendant.

Pour participer, les individus doivent également donner leur consentement écrit à un protocole approuvé par le comité d'éthique de l'hôpital Virgen de Valme, après en avoir été informé oralement et par écrit. Ils seront incités à éviter la consommation de boissons alcoolisées et de tabac la veille de l'exécution des essais.

Sous-activité 2.2. Détermination de la taille de l'échantillon. La variable quantitative à examiner dans cette étude est la concentration plasmatique postprandiale de triglycérides. En supposant que la concentration en triglycérides sera réduite d'au moins 10 % suite à la consommation d'huile de grignons d'olive par rapport à l'huile de tournesol à haute teneur en acide oléique et en considérant une sécurité d'étude de 95 % (risque α 0,05 ; zα 1,645) et une puissance de 90 % (zβ 1,282), un échantillon de 16 volontaires est obtenu. En raison d'éventuels refus de volontaires (bien qu'aucun effet indésirable ne soit attendu), il est considéré comme prudent d'augmenter la taille de l'échantillon à 20 sujets par groupe.

Sous-activité 2.3. Administration de repas expérimentaux Le jour de l'essai, et après 12 heures de jeûne nocturne, chaque participant se verra prélever un échantillon de sang par ponction de la veine cubitale. Ils recevront ensuite une dose d'huile de grignons d'olive ou d'huile de tournesol à haute teneur en acide oléique, qu'ils consommeront dans le cadre d'un petit-déjeuner comprenant du café ou du lait et des toasts avec du pain complet. Après ingestion, chaque participant aura des aliquotes de sang prélevées toutes les heures pendant une période postprandiale de 7 heures. Pendant cette période, le libre accès à la prise d’eau sera autorisé.

ACTIVITÉ 3. ISOLATION ET CARACTÉRISATION DES LIPOPROTÉINES HUMAINES RICHES EN TRIGLYCÉRIDES (TRL)

Sous-activité 3.1. Déterminations dans le sérum sanguin À partir des aliquotes de sang cubitale obtenues, le sérum doit être obtenu par centrifugation et du NaN3, du PMSF et de l'aprotinine doivent être ajoutés comme conservateurs pour éviter la dégradation protéolytique. Les sérums seront conservés à -80 °C jusqu'à l'analyse. Dans le sérum sanguin, la concentration en triglycérides sera déterminée par spectrophotométrie et la concentration en apolipoprotéine B par immunoturbidimétrie. Ces mesures permettront de suivre l'évolution de la formation et de la clairance postprandiale des TRL. De plus, les concentrations sériques d'acide oléanolique, d'alpha-tocophérol et de bêta-sitostérol seront déterminées. Un système analytique d'extraction et de fractionnement sera suivi, utilisant la méthode GC-MS développée dans notre laboratoire pour l'identification-quantification du triterpène.

Sous-activité 3.2. Isolement et caractérisation des lipoprotéines riches en triglycérides (TRL) La présence d'acide oléanolique dans les TRL isolées par ultracentrifugation des sérums obtenus lors du test postprandial sera étudiée. La teneur en acides gras et en TG ainsi que les apo B48 et B100, en tant que marqueurs de la présence de chylomicrons et de VLDL, seront déterminées par ELISA. Ces mêmes particules seront utilisées pour l'étude d'activation microgliale (Activité 4).

ACTIVITÉ 4. ACTIVATION MICROGLIALE DANS LES CELLULES BV-2 HUMAINES TRAITÉES PAR TRL Dans cette activité, la lignée cellulaire de souris BV-2 sera utilisée comme modèle de cellules microgliales. Ce type de cellule sera cultivé dans du milieu DMEM additionné de 10 % de FBS inactivé par la chaleur, de streptomycine (100 mg/ml) et de pénicilline (100 UI/ml), sous 100 % d'humidité et 5 % de CO2. Les expériences seront réalisées dans un milieu réduit à 5 % de FBS. Les cellules seront traitées avec les TRL obtenus lors du test postprandial. Les soins seront maintenus pendant 24h.

Sous-activité 4.1. Effet du TRL humain sur la viabilité cellulaire Tout d'abord, la viabilité cellulaire doit être mesurée par la méthode MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium). Après 24 h d'incubation, les cellules doivent être lavées avec du milieu frais additionné de 5 % de FBS et traitées avec du TRL pendant 12, 24 et 36 h. Les cellules doivent être lavées avec du milieu frais additionné de 5 % de FBS et traitées avec du TRL pendant 12, 24 et 36 h. La solution MTT doit ensuite être ajoutée. Le précipité de formazan résultant sera dissous dans du DMSO et la viabilité cellulaire sera quantifiée en mesurant l'absorbance à 490 nm.

Sous-activité 4.2. Effet sur la production de ROS et l'activité redox La sonde fluorescente 2',7'-dichlorofluorescéine-diacétate (DCFH-DA), qui diffuse à travers la membrane cellulaire et est hydrolysée par les estérases intracellulaires pour former du DCFH non fluorescent, sera utilisée pour déterminer la concentration intracellulaire de ROS. En présence de ROS, le DCFH est rapidement oxydé pour former de la dichlorofluorescéine (DCF) hautement fluorescente. L'intensité de la fluorescence émise (excitation à 485 nm, émission à 825 nm) est proportionnelle à la concentration intracellulaire de ROS.

Le glutathion total ainsi que le glutathion oxydé seront déterminés par la méthode enzymatique, basée sur l'activité GSSG réductase dépendante du NADPH, qui surveille spectrophotométriquement le complexe formé par le GSH et l'acide dithionitrobenzoïque (DTNB).

Sous-activité 4.3. Effet des TRL humains sur la production de cytokines Les cellules BV-2 seront traitées avec des TRL postprandiaux et la production de cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires dans le surnageant de culture sera déterminée à l'aide de kits ELISA commerciaux selon les protocoles du fabricant.

Sous-activité 4.4. Effet des TRL humains sur l'expression du gène des cytokines Les cellules BV-2 seront traitées avec des TRL postprandiales et l'ARNm sera isolé. Pour déterminer l'expression génique des cytokines d'intérêt, la technique de PCR en temps réel après rétrotranscription en ADNc sera utilisée, en utilisant des amorces conçues à cet effet.