Ослабление постпрандиальных воспалительных процессов у больных болезнью Альцгеймера при употреблении масла выжимок (CORDIAL)

1. ФОН

   Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной причиной деменции, и ожидается, что к 2050 году ее распространенность увеличится в четыре раза. Для болезни Альцгеймера характерна значительная гибель нейронов и хроническое воспаление, которое связано с цереброваскулярным и паренхиматозным накоплением белковых отложений, обогащенных бета-амилоидом (Аβ) и гиперфосфорилированным белком Тау. Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что нарушение функции гематоэнцефалического барьера, отделяющего центральную нервную систему от периферического кровообращения, может повысить риск возникновения и ухудшить течение АД.

   Предполагается, что микроглия играет решающую роль в большинстве нейропатологий, поскольку она активируется при обнаружении изменений в гомеостазе мозга. Этот тип клеток действует как резидентные макрофаги в мозге, постоянно сканируя местное микроокружение на предмет признаков инфекции и повреждения и активируясь при их обнаружении. В результате высвобождается множество провоспалительных медиаторов, включая цитокины, активные формы кислорода (АФК) и оксид азота. Напротив, системы антиоксидантной защиты, такие как глутатионпероксидаза-1 и супероксиддисмутаза-1, у пациентов с AD снижены.

   Значительная часть Aβ плазмы связана с липопротеинами, богатыми триглицеридами (TRL), которые секретируются гепатоцитами и энтероцитами. Эти частицы характеризуются аполипопротеином В, который служит индикатором постпрандиальной дислипидемии, которая представляет собой преувеличенное, но преходящее увеличение ТРЛ после всасывания пищевых жиров и приводит к формированию атеросклероза. Это явление может быть связующим звеном между сердечно-сосудистыми заболеваниями и болезнью Альцгеймера. Существование такой связи уже было продемонстрировано в клинических и перекрестных исследованиях, но основной механизм остается неясным.

   Появляется все больше доказательств того, что потребление жиров с пищей связано с возникновением и прогрессированием болезни Альцгеймера. Таким образом, потребление насыщенных жирных кислот (НЖК) может быть вредным фактором, способствующим дислипидемии, эндотелиальной дисфункции, воспалению и окислительному стрессу. Напротив, потребление жиров, богатых поли- или мононенасыщенными жирными кислотами (ПНЖК и МНЖК), связано с более низкой распространенностью заболеваний, вероятно, как следствие более низкого уровня системного воспаления.

   Масло оливковых выжимок получают из твердого побочного продукта производства оливкового масла путем экстракции растворителем или центрифугирования. Срок хранения этого побочного продукта позволяет обогащать масло компонентами кожуры плодов и листьев деревьев, представляющими большой интерес из-за их биологической активности, которые обнаруживаются только в следовых количествах в оливковом масле первого отжима. Таким образом, центрифугированное масло оливковых выжимок обогащено жирорастворимыми компонентами неомыляемой фракции. Хотя часть этих соединений теряется при переработке, при мягких условиях переработки они могут сохраняться в соответствующих концентрациях. Эти компоненты включают стерины и токоферолы, а также тритерпеновые кислоты, олеаноловую и маслиновую.

   В предыдущих исследованиях in vitro исследователи продемонстрировали, что биологически активные соединения в масле оливковых выжимок — альфа-токоферол, олеаноловая кислота и бета-ситостерин — способны ослаблять активацию микроглии как изолированно, так и в составе искусственных липопротеинов, богатых триглицеридами (TRL). Ослабление микроглии определяли путем измерения различных маркеров воспаления и окислительного стресса, которые высвобождаются клеткой при стимуляции, приводящей к сверхактивации. Это открытие открыло возможность того, что, если эти биологически активные соединения достигнут мозга, они могут помочь предотвратить или замедлить развитие нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.

   Затем исследователи провели сравнительное постпрандиальное исследование, чтобы определить, способны ли человеческие TRL, полученные после приема масла оливковых выжимок, ослаблять активацию микроглии в большей степени, чем те, которые были получены после приема высокоолеинового подсолнечного масла. Исследователи обнаружили, что в определенные моменты постпрандиального периода высвобождение маркеров воспаления и окислительного стресса клетками микроглии, обработанными TRL, было ниже, если они были получены из масла оливковых выжимок. Таким образом, было продемонстрировано, что у здоровых людей потребление масла выжимок в постпрандиальный период приводит к выработке липопротеинов, несущих его биологически активные соединения, и что они участвуют в ослаблении активации микроглии.

   Следовательно, исследователи полагают, что пришло время проверить нашу гипотезу на пациентах с диагнозом болезнь Альцгеймера, у которых наблюдаются проблемы с памятью или начинающиеся когнитивные нарушения. В рамках этого проекта исследователи предполагают, что у этих пациентов будут наблюдаться изменения в постпрандиальном липидном обмене, которые приведут к тому, что ТРЛ будет иметь большую способность сверхактивировать микроглию, но прием масла выжимок ослабит эту активацию. Если это так, то можно предположить, что потребление масла выжимок может предотвратить нейровоспаление, вызванное гиперактивацией микроглии, снижая риск развития и прогрессирования болезни Альцгеймера.

2. РАБОЧАЯ ГИПОТЕЗА

   Этот проект основан на демонстрации того, что TRL, как искусственного, так и человеческого происхождения, способен вызывать активацию микроглии — явление, связанное с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера. Кроме того, было показано, что потребление оливкового масла из выжимок и его биологически активных соединений способно ослабить эту активацию. Подход этого исследовательского проекта заключается в том, что потребление оливкового масла из выжимок пациентами с болезнью Альцгеймера приведет к образованию постпрандиального TRL, который поддерживает эти биологически активные соединения и, таким образом, сохраняет свою защитную способность против активации и воспаления микроглии.

   Если это так, то полученные доказательства заложат основу для разработки новых медицинских применений масла из выжимок, которые будут основаны на влиянии TRL, образующегося в постпрандиальном периоде, и которые можно будет использовать для профилактики и лечения болезни Альцгеймера. болезнь.

3. ЦЕЛИ

Для проверки приведенной выше гипотезы будут решены следующие конкретные задачи:

1. Определить возможные изменения постпрандиального липидного обмена у пациентов с легкой или ранней стадией диагностированной болезни Альцгеймера.
2. Оценить, способен ли прием масла выжимок нормализовать эти изменения постпрандиального липидного обмена по сравнению с высокоолеиновым подсолнечным маслом.
3. Получить и охарактеризовать ТРЛ человека, полученного после приема масла выжимок или высокоолеинового подсолнечного масла.
4. Оценить ослабляющий эффект активации микроглии TRL, полученный после приема масла выжимок по сравнению с высокоолеиновым подсолнечным маслом.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОЕКТИРОВАНИЕ И ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

Исследование спроектировано как рандомизированное двойное слепое постпрандиальное перекрестное исследование с участием пациентов с болезнью Альцгеймера, которые будут случайным образом разделены на две группы и будут сравниваться со здоровыми людьми того же возраста. Все субъекты будут получать масло из выжимок и высокоолеиновое подсолнечное масло.

ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ 1. ПОЛУЧЕНИЕ МАСЛА ВЫМЖМ, БОГАТОГО БИОАКТИВНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ

Оливковое масло из выжимок будет предоставлено компанией ORIVA, а высокоолеиновое подсолнечное масло будет коммерческого происхождения. Оба масла будут охарактеризованы в Институте де ла Граса-CSIC для определения содержания в них кислот и тритерпеновых спиртов, токоферолов и стеролов.

ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ 2. ОТБОР ВОЛОНТЕРОВ И ВНЕДРЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МАСЕЛ

Подмероприятие 2.1. Отбор волонтеров

Постпрандиальное исследование будет проводиться в соответствии с основополагающими принципами Хельсинкской декларации, Конвенции Совета Европы и Всеобщей декларации ЮНЕСКО и пройдет в отделении неврологии больницы Вирхен де Вальме в Севилье. Взрослых добровольцев будут отбирать из числа тех, у кого диагностирована болезнь Альцгеймера, на основании результатов клинических и когнитивных тестов с использованием стандартных критериев, а также с использованием специфических биомаркеров. Критерии включения также будут включать адекватные зрительные и слуховые способности, а также наличие последующих записей о развитии заболевания медицинским персоналом. Критерии исключения будут включать клинически значимые психические расстройства; системное заболевание или инфекция, которые могут повлиять на безопасность; сердечно-сосудистые заболевания в течение последних 2 лет; неконтролируемая артериальная гипертензия в течение последних 6 месяцев; рак в течение последних 5 лет; злоупотребление наркотиками или алкоголем в течение последних 2 лет; и инсулинозависимый диабет.

Для участия отдельные лица также должны дать письменное согласие на протокол, утвержденный Комитетом по этике больницы Вирхен де Вальме, после получения уведомления как в устной, так и в письменной форме. Им будет рекомендовано избегать употребления алкогольных напитков и табака в течение дня, предшествующего проведению испытаний.

Подмероприятие 2.2. Определение размера выборки. Количественной переменной, которую необходимо изучить в этом исследовании, является постпрандиальная концентрация триглицеридов в плазме. Предполагая, что концентрация триглицеридов снизится как минимум на 10 % в результате потребления оливкового масла из выжимок по сравнению с высокоолеиновым подсолнечным маслом, а также принимая во внимание безопасность исследования 95 % (риск α 0,05; zα 1,645) и степень 90 % (zβ 1,282), получен размер выборки из 16 добровольцев. Из-за возможных отказов добровольцев (хотя никаких побочных эффектов не ожидается) считается разумным увеличить размер выборки до 20 человек на группу.

Подмероприятие 2.3. Введение экспериментального питания. В день исследования и после 12 часов ночного голодания у каждого участника будет взят образец крови путем пункции локтевой вены. Затем они получат дозу оливкового масла из выжимок или высокоолеинового подсолнечного масла, которое они съедят во время завтрака, включая кофе или молоко и тосты с цельнозерновым хлебом. После приема внутрь у каждого участника будут брать аликвоты крови каждый час в течение 7 часов после приема пищи. В это время будет разрешен свободный доступ к водозабору.

ЗАДАНИЕ 3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЛИПОПРОТЕИНОВ, БОГАТЫХ ТРИГЛИЦЕРИДАМИ (ТРЛ)

Подвид деятельности 3.1. Определения в сыворотке крови. Из полученных аликвот кубитальной крови сыворотку получают центрифугированием и добавляют NaN3, PMSF и апротинин в качестве консервантов во избежание протеолитической деградации. Сыворотку хранят при температуре -80°C до проведения анализа. В сыворотке крови концентрацию триглицеридов определяют спектрофотометрически, а концентрацию аполипопротеина В - иммунотурбидиметрически. Эти измерения позволят отслеживать эволюцию постпрандиального формирования и клиренса TRL. Кроме того, будут определены концентрации в сыворотке олеаноловой кислоты, альфа-токоферола и бета-ситостерина. Будет использоваться система аналитической экстракции и фракционирования с использованием метода ГХ-МС, разработанного в нашей лаборатории для идентификации и количественного определения тритерпена.

Подмероприятие 3.2. Выделение и характеристика липопротеинов, богатых триглицеридами (TRL). Будет исследовано наличие олеаноловой кислоты в TRL, выделенном ультрацентрифугированием сывороток, полученных в постпрандиальном анализе. Содержание жирных кислот и ТГ, а также апо B48 и B100, как маркеров присутствия хиломикронов и ЛПОНП, будут определять с помощью ELISA. Эти же частицы будут использоваться для исследования активации микроглии (Мероприятие 4).

ЗАДАНИЕ 4. МИКРОГЛИАЛЬНАЯ АКТИВАЦИЯ В ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ КЛЕТКАХ BV-2, ОБРАБОТАННЫХ TRL. В этом занятии линия клеток мыши BV-2 будет использоваться в качестве модели микроглиальных клеток. Этот тип клеток будет культивироваться в среде DMEM, дополненной 10% инактивированной нагреванием FBS, стрептомицином (100 мг/мл) и пенициллином (100 МЕ/мл), при 100% влажности и 5% CO2. Эксперименты будут проводиться в среде, восстановленной 5% FBS. Клетки будут обрабатываться TRL, полученными в постпрандиальном анализе. Процедуры будут сохраняться в течение 24 часов.

Подмероприятие 4.1. Влияние человеческого TRL на жизнеспособность клеток. Сначала жизнеспособность клеток измеряют методом МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий). После инкубации в течение 24 часов клетки промывают свежей средой с добавлением 5% FBS и обрабатывают TRL в течение 12, 24 и 36 часов. Клетки промывают свежей средой с добавлением 5% FBS и обрабатывают TRL в течение 12, 24 и 36 часов. Затем должно быть добавлено решение MTT. Полученный осадок формазана растворяют в ДМСО и количественно определяют жизнеспособность клеток путем измерения оптической плотности при 490 нм.

Подмероприятие 4.2. Влияние на выработку АФК и окислительно-восстановительную активность. Для определения содержания АФК и окислительно-восстановительной активности будет использоваться флуоресцентный зонд 2',7'-дихлорфлуоресцеин-диацетат (DCFH-DA), который диффундирует через клеточную мембрану и гидролизуется внутриклеточными эстеразами с образованием нефлуоресцентного DCFH. внутриклеточная концентрация АФК. В присутствии АФК DCFH быстро окисляется с образованием высокофлуоресцентного дихлорфлуоресцеина (DCF). Интенсивность излучаемой флуоресценции (возбуждение 485 нм, эмиссия 825 нм) пропорциональна внутриклеточной концентрации АФК.

Общий глутатион, а также окисленный глутатион будут определять ферментативным методом, основанным на НАДФН-зависимой активности GSSG-редуктазы, который спектрофотометрически контролирует комплекс, образуемый GSH и дитионитробензойной кислотой (ДТНБ).

Подмероприятие 4.3. Влияние человеческих TRL на продукцию цитокинов Клетки BV-2 будут обрабатываться постпрандиальными TRL, а выработка провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в культуральном супернатанте будет определяться с использованием коммерческих наборов ELISA в соответствии с протоколами производителя.

Подмероприятие 4.4. Влияние человеческих TRL на экспрессию генов цитокинов. Клетки BV-2 будут обрабатываться постпрандиальными TRL и выделяться мРНК. Для определения экспрессии генов интересующих цитокинов будет использоваться метод ПЦР в реальном времени после ретротранскрипции кДНК с использованием праймеров, предназначенных для этой цели.