Osłabienie poposiłkowych procesów zapalnych u pacjentów z chorobą Alzheimera poprzez spożywanie oleju z wytłoków (CORDIAL)

1. TŁO

   Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszą przyczyną demencji, a oczekuje się, że jej częstość występowania wzrośnie czterokrotnie do roku 2050. Choroba Alzheimera charakteryzuje się patologicznie znaczną utratą neuronów i przewlekłym stanem zapalnym, co jest związane z gromadzeniem się złogów białka w naczyniach mózgowych i miąższu, wzbogaconych w amyloid beta (Aβ) i hiperfosforylowane białko Tau. Coraz liczniejsze dowody sugerują, że zaburzenie funkcji bariery krew-mózg, która oddziela ośrodkowy układ nerwowy od krążenia obwodowego, może zwiększać ryzyko wystąpienia i pogarszać przebieg choroby Alzheimera.

   Sugeruje się, że mikroglej odgrywa kluczową rolę w większości neuropatologii, ponieważ ulega aktywacji po wykryciu zmian w homeostazie mózgu. Ten typ komórek działa jak makrofagi rezydentne w mózgu, stale skanując lokalne mikrośrodowisko w poszukiwaniu oznak infekcji i urazów, a gdy zostaną znalezione, ulegają aktywacji. W rezultacie uwalnianych jest wiele mediatorów prozapalnych, w tym cytokiny, reaktywne formy tlenu (ROS) i tlenek azotu. Natomiast systemy obrony antyoksydacyjnej, takie jak peroksydaza glutationowa-1 i dysmutaza ponadtlenkowa-1, są osłabione u pacjentów z AD.

   Znacząca część Aβ w osoczu jest związana z lipoproteinami bogatymi w triglicerydy (TRL), które są wydzielane z hepatocytów i enterocytów. Cząsteczki te charakteryzują się obecnością apolipoproteiny B, która służy jako wskaźnik dyslipidemii poposiłkowej, czyli nadmiernego, ale przemijającego wzrostu TRL po wchłonięciu tłuszczu z diety i prowadzącego do powstania miażdżycy. Zjawisko to może być powiązaniem między chorobami układu krążenia a chorobą Alzheimera. Istnienie takiego powiązania wykazano już w badaniach klinicznych i przekrojowych, lecz leżący u jego podstaw mechanizm pozostaje niejasny.

   Istnieje coraz więcej dowodów na to, że spożycie tłuszczów w diecie jest powiązane z wystąpieniem i postępem choroby Alzheimera. Zatem spożycie nasyconych kwasów tłuszczowych (SFA) byłoby czynnikiem szkodliwym, sprzyjającym dyslipidemii, dysfunkcji śródbłonka, stanom zapalnym i stresowi oksydacyjnemu. Natomiast spożycie tłuszczów bogatych w wielo- lub jednonienasycone kwasy tłuszczowe (PUFA i MUFA) wiąże się z mniejszą częstością występowania chorób, prawdopodobnie w wyniku mniejszego poziomu ogólnoustrojowego stanu zapalnego.

   Oliwę z wytłoków z oliwek otrzymuje się ze stałego produktu ubocznego produkcji oliwy z oliwek w drodze ekstrakcji rozpuszczalnikiem lub wirowania. Okres przechowywania tego produktu ubocznego pozwala na wzbogacenie oliwy w składniki skórki owoców i liści drzew, bardzo interesujące ze względu na ich aktywność biologiczną, które występują jedynie w śladowych ilościach w oliwie z oliwek pierwszego tłoczenia. Tym samym odwirowana oliwa z wytłoków z oliwek jest wzbogacona w składniki frakcji niezmydlającej się, które są rozpuszczalne w tłuszczach. Chociaż część tych związków jest tracona podczas rafinacji, w łagodnych warunkach rafinacji można je zachować w odpowiednich stężeniach. Składniki te obejmują sterole i tokoferole, a także kwasy triterpenowe, oleanolowy i maslinowy.

   W poprzednich badaniach in vitro badacze wykazali, że bioaktywne związki zawarte w oliwie z wytłoczyn z oliwek, alfa-tokoferol, kwas oleanolowy i beta-sitosterol, były w stanie osłabić aktywację mikrogleju, zarówno samodzielnie, jak i jako część sztucznych lipoprotein bogatych w triglicerydy (TRL). Tłumienie mikrogleju określono poprzez pomiar różnych markerów stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego, które są uwalniane przez komórkę poddaną stymulacji prowadzącej do nadmiernej aktywacji. Odkrycie to otworzyło drzwi do możliwości, że jeśli te bioaktywne związki dotrą do mózgu, mogą pomóc w zapobieganiu lub spowalnianiu rozwoju chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera.

   Następnie badacze przeprowadzili porównawcze badanie poposiłkowe, aby ustalić, czy ludzki TRL uzyskany po spożyciu oliwy z wytłoków z oliwek był w stanie osłabić aktywację mikrogleju w większym stopniu niż te uzyskane po spożyciu wysokooleinowego oleju słonecznikowego. Badacze odkryli, że w pewnych momentach okresu poposiłkowego uwalnianie markerów stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego przez komórki mikrogleju poddane działaniu TRL było niższe, gdy pochodziły one ze spożycia oliwy z wytłoków z oliwek. Tym samym wykazano, że u zdrowych osób spożywanie oleju z wytłoków z wytłoków w okresie poposiłkowym powoduje produkcję lipoprotein niosących jego związki bioaktywne, które uczestniczą w osłabianiu aktywacji mikrogleju.

   W związku z tym badacze uważają, że nadszedł czas, aby przetestować naszą hipotezę u pacjentów, u których zdiagnozowano chorobę Alzheimera, u których występują problemy z pamięcią lub początkowe upośledzenie funkcji poznawczych. Na potrzeby tego projektu badacze postawili hipotezę, że u tych pacjentów wystąpią zmiany w poposiłkowym metabolizmie lipidów, które spowodują, że TRL będzie miał większą zdolność do nadmiernej aktywacji mikrogleju, ale spożycie oleju z wytłoków osłabi tę aktywację. Jeśli tak jest, sugeruje to, że spożycie oleju z wytłoków może zapobiegać zapaleniu układu nerwowego spowodowanego nadmierną aktywacją mikrogleju, zmniejszając ryzyko rozwoju i postępu choroby Alzheimera.

2. HIPOTEZA ROBOCZA

   Projekt ten opiera się na wykazaniu, że TRL, zarówno sztuczne, jak i pochodzenia ludzkiego, są w stanie wywołać aktywację mikrogleju, zjawisko związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera. Ponadto wykazano, że spożywanie oliwy z wytłoków z oliwek i jej związków bioaktywnych może osłabić tę aktywację. Podejście przyjęte w tym projekcie badawczym zakłada, że ​​spożywanie oliwy z wytłoków z oliwek przez pacjentów z chorobą Alzheimera doprowadzi do powstania poposiłkowych TRL, które utrzymują te bioaktywne związki, a tym samym zachowują swoje właściwości ochronne przed aktywacją mikrogleju i stanem zapalnym.

   Jeżeli tak jest, uzyskane dowody położą podwaliny pod rozwój nowych zastosowań zdrowotnych olejku z wytłoków, które opierałyby się na wpływie TRL powstającego w okresie poposiłkowym i które można by wykorzystać w profilaktyce i leczeniu choroby Alzheimera choroba.

3. CELE

Aby przetestować powyższą hipotezę, zostaną uwzględnione następujące cele szczegółowe:

1. Określenie możliwych zmian w poposiłkowym metabolizmie lipidów u pacjentów z łagodną lub wcześnie rozpoznaną chorobą Alzheimera.
2. Ocena, czy spożycie oleju z wytłoków jest w stanie normalizować te zmiany w poposiłkowym metabolizmie lipidów w porównaniu z wysokooleinowym olejem słonecznikowym.
3. Uzyskanie i scharakteryzowanie ludzkiego TRL uzyskanego po spożyciu oleju z wytłoków lub wysokooleinowego oleju słonecznikowego.
4. Ocena osłabiającego efektu aktywacji mikrogleju przez TRL uzyskanego po spożyciu oleju z wytłoków w porównaniu z wysokooleinowym olejem słonecznikowym.

4. PROJEKTOWANIE EKSPERYMENTALNE I DZIAŁANIA

Badanie zaprojektowano jako randomizowane, podwójnie ślepe, poposiłkowe badanie krzyżowe z udziałem pacjentów z chorobą Alzheimera, którzy zostaną losowo podzieleni na dwie grupy i porównani ze zdrowymi grupami kontrolnymi w tym samym wieku. Wszyscy badani otrzymają olej z wytłoków i wysokooleinowy olej słonecznikowy.

DZIAŁANIE 1. UZYSKANIE OLEJU Z WYTŁOKÓW BOGATEGO W ZWIĄZKI BIOAKTYWNE

Oliwa z wytłoków z oliwek dostarczy firma ORIVA, natomiast wysokooleinowy olej słonecznikowy będzie pochodzenia handlowego. Obydwa olejki zostaną scharakteryzowane w Instituto de la Grasa-CSIC w celu określenia ich zawartości alkoholi kwasowych i triterpenowych, tokoferoli i steroli.

DZIAŁANIE 2. WYBÓR WOLONTARIUSZY I PODANIE OLEJÓW EKSPERYMENTALNYCH

Poddziałanie 2.1. Wybór ochotników

Badanie poposiłkowe zostanie przeprowadzone zgodnie z podstawowymi zasadami Deklaracji Helsińskiej, Konwencji Rady Europy i Powszechnej Deklaracji UNESCO i odbędzie się na Oddziale Neurologii Szpitala Virgen de Valme w Sewilli. Dorośli ochotnicy zostaną wybrani spośród osób, u których zdiagnozowano chorobę Alzheimera, na podstawie wyników testów klinicznych i poznawczych, z zastosowaniem standardowych kryteriów oraz z wykorzystaniem specyficznych biomarkerów. Kryteria włączenia będą również obejmować odpowiednie zdolności wzrokowe i słuchowe oraz posiadanie przez personel medyczny dalszych zapisów rozwoju choroby. Kryteria wykluczenia będą obejmować klinicznie istotne zaburzenia psychiczne; choroba ogólnoustrojowa lub infekcja, która może mieć wpływ na bezpieczeństwo; choroba sercowo-naczyniowa w ciągu ostatnich 2 lat; niekontrolowane nadciśnienie w ciągu ostatnich 6 miesięcy; nowotwór złośliwy w ciągu ostatnich 5 lat; nadużywanie narkotyków lub alkoholu w ciągu ostatnich 2 lat; i cukrzycę insulinozależną.

Aby wziąć udział w badaniu, wymagane jest również wyrażenie pisemnej zgody na protokół zatwierdzony przez Komisję ds. etyki szpitala Virgen de Valme, po uzyskaniu ustnego i pisemnego powiadomienia. Będą zachęcani do unikania spożywania napojów alkoholowych i wyrobów tytoniowych w dniu poprzedzającym przeprowadzenie rozpraw.

Poddziałanie 2.2. Określenie wielkości próby. Zmienną ilościową, którą należy zbadać w tym badaniu, jest poposiłkowe stężenie triglicerydów w osoczu. Zakładając, że w wyniku spożycia oliwy z wytłoków z oliwek w porównaniu z wysokooleinowym olejem słonecznikowym, stężenie triglicerydów obniży się o co najmniej 10% oraz bezpieczeństwo badania na poziomie 95% (ryzyko α 0,05; zα 1,645) i moc 90% (zβ 1,282) uzyskuje się próbę liczącą 16 ochotników. Ze względu na możliwość odmowy udziału ochotników (chociaż nie oczekuje się żadnych działań niepożądanych) za rozsądne uważa się zwiększenie próby do 20 osób na grupę.

Poddziałanie 2.3. Podawanie posiłków eksperymentalnych W dniu badania oraz po 12 godzinach całonocnego postu od każdego uczestnika zostanie pobrana próbka krwi poprzez nakłucie żyły łokciowej. Otrzyma wówczas dawkę oliwy wytłoczynowej lub wysokooleinowego oleju słonecznikowego, którą zje w ramach śniadania składającego się z kawy lub mleka i tostu z pełnoziarnistego pieczywa. Po spożyciu od każdego uczestnika będą pobierane porcje krwi co godzinę przez okres 7 godzin po posiłku. W tym czasie umożliwiony będzie swobodny dostęp do ujęcia wody.

DZIAŁANIE 3. IZOLACJA I CHARAKTERYSTYKA LUDZKICH LIPOPROTEIN BOGATECH W TRL (TRL)

Poddziałanie 3.1. Oznaczenia w surowicy krwi Z otrzymanych próbek krwi łokciowej surowicę otrzymuje się przez odwirowanie i dodaje się NaN3, PMSF i aprotyninę jako środki konserwujące, aby uniknąć degradacji proteolitycznej. Surowice będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu analizy. W surowicy krwi stężenie trójglicerydów będzie oznaczane metodą spektrofotometryczną, a stężenie apolipoproteiny B metodą immunoturbidymetryczną. Pomiary te umożliwią monitorowanie ewolucji poposiłkowego tworzenia i klirensu TRL. Dodatkowo w surowicy zostanie oznaczone stężenie kwasu oleanolowego, alfa-tokoferolu i beta-sitosterolu. Zastosowany zostanie analityczny system ekstrakcji i frakcjonowania, wykorzystujący opracowaną w naszym laboratorium metodę GC-MS do identyfikacji i oznaczania ilościowego triterpenu.

Poddziałanie 3.2. Izolacja i charakterystyka lipoprotein bogatych w triglicerydy (TRL) Zbadana zostanie obecność kwasu oleanolowego w TRL wyizolowanym poprzez ultrawirowanie surowic uzyskanych w teście poposiłkowym. Zawartość kwasów tłuszczowych i TG oraz apo B48 i B100, jako markery obecności chylomikronów i VLDL, zostanie oznaczona metodą ELISA. Te same cząstki zostaną wykorzystane w badaniu aktywacji mikrogleju (Ćwiczenie 4).

ĆWICZENIE 4. AKTYWACJA MIKROgleju W LUDZKICH KOMÓRKACH BV-2 traktowanych TRL W tym ćwiczeniu linia komórek mysich BV-2 zostanie użyta jako model komórek mikrogleju. Komórki tego typu będą hodowane w pożywce DMEM uzupełnionej 10% inaktywowanym ciepłem FBS, streptomycyną (100 mg/ml) i penicyliną (100 IU/ml), w warunkach 100% wilgotności i 5% CO2. Doświadczenia będą przeprowadzane w pożywce o zmniejszonej zawartości 5% FBS. Komórki będą traktowane TRL otrzymanymi w teście poposiłkowym. Zabiegi będą utrzymywane przez 24h.

Poddziałanie 4.1. Wpływ ludzkiej TRL na żywotność komórek Najpierw mierzy się żywotność komórek metodą MTT (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoli). Po inkubacji przez 24 godziny komórki przemywa się świeżą pożywką uzupełnioną 5% FBS i traktuje TRL przez 12, 24 i 36 godzin. Komórki przemywa się świeżą pożywką uzupełnioną 5% FBS i traktuje TRL przez 12, 24 i 36 godzin. Następnie dodaje się roztwór MTT. Powstały osad formazanu zostanie rozpuszczony w DMSO, a żywotność komórek zostanie określona ilościowo poprzez pomiar absorbancji przy 490 nm.

Poddziałanie 4.2. Wpływ na wytwarzanie RFT i aktywność redoks Do określenia stężenia zostanie wykorzystana sonda fluorescencyjna 2',7'-dioctan dichlorofluoresceiny (DCFH-DA), która dyfunduje przez błonę komórkową i jest hydrolizowana przez wewnątrzkomórkowe esterazy, tworząc niefluorescencyjny DCFH. wewnątrzkomórkowe stężenie ROS. W obecności RFT DCFH ulega szybkiemu utlenieniu, tworząc wysoce fluorescencyjną dichlorofluoresceinę (DCF). Intensywność emitowanej fluorescencji (wzbudzenie 485 nm, emisja 825 nm) jest proporcjonalna do wewnątrzkomórkowego stężenia ROS.

Glutation całkowity i utleniony będzie oznaczany metodą enzymatyczną, opartą na aktywności reduktazy GSSG zależnej od NADPH, która spektrofotometrycznie monitoruje kompleks utworzony przez GSH i kwas ditionitrobenzoesowy (DTNB).

Poddziałanie 4.3. Wpływ ludzkich TRL na wytwarzanie cytokin Komórki BV-2 będą traktowane poposiłkowymi TRL, a wytwarzanie cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych w supernatancie hodowli zostanie określone przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA zgodnie z protokołami producenta.

Poddziałanie 4.4. Wpływ ludzkich TRL na ekspresję genu cytokin Komórki BV-2 będą traktowane poposiłkowymi TRL i izolowany będzie mRNA. Aby określić ekspresję genów interesujących nas cytokin, zostanie zastosowana technika PCR w czasie rzeczywistym po retrotranskrypcji na cDNA, przy użyciu zaprojektowanych do tego celu starterów.