포마스 오일 섭취에 따른 알츠하이머병 환자의 식후 염증 과정 약화 (CORDIAL)

1. 배경

   알츠하이머병(AD)은 치매의 가장 흔한 원인이며, 그 유병률은 2050년까지 4배로 증가할 것으로 예상됩니다. 알츠하이머병은 병리학적으로 상당한 신경 손실과 만성 염증을 특징으로 하며, 이는 아밀로이드 베타(Aβ)와 과인산화된 타우 단백질이 풍부한 단백질 침전물의 뇌혈관 및 실질 축적과 관련되어 있습니다. 축적된 증거는 중추신경계를 말초 순환계와 분리하는 혈액뇌장벽 기능의 붕괴가 AD 발병 위험을 증가시키고 AD 경과를 악화시킬 수 있음을 시사합니다.

   소교세포는 뇌 항상성의 변화가 감지되면 활성화되기 때문에 대부분의 신경병리학에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었습니다. 이 세포 유형은 뇌에 상주하는 대식세포처럼 작용하여 감염 및 부상의 징후가 있는지 국소 미세환경을 지속적으로 검사하고 발견되면 활성화됩니다. 그 결과, 사이토카인, 활성산소종(ROS) 및 산화질소를 포함한 다수의 염증 유발 매개체가 방출됩니다. 대조적으로, 글루타티온 퍼옥시다제-1 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1과 같은 항산화 방어 시스템은 AD 환자에서 감소됩니다.

   혈장 Aβ의 상당 부분은 간세포와 장세포에서 분비되는 트리글리세리드가 풍부한 지질단백질(TRL)과 연관되어 있습니다. 이러한 입자는 식후 이상지질혈증의 지표 역할을 하는 아포지단백질 B를 특징으로 하며, 이는 식이 지방 흡수 후 TRL이 과도하지만 일시적으로 증가하고 죽상동맥경화증을 유발합니다. 이 현상은 심혈관 질환과 알츠하이머병 사이의 연관성일 수 있습니다. 이러한 연관성의 존재는 이미 임상 및 단면 연구에서 입증되었지만 기본 메커니즘은 아직 불분명합니다.

   식이 지방 섭취가 알츠하이머병의 발병 및 진행과 관련이 있다는 증거가 축적되어 있습니다. 따라서 포화지방산(SFA) 섭취는 이상지질혈증, 내피 기능 장애, 염증 및 산화 스트레스를 촉진하는 해로운 요인이 될 수 있습니다. 대조적으로, 다중불포화지방산 또는 단일불포화지방산(PUFA 및 MUFA)이 풍부한 지방을 섭취하면 질병 유병률이 낮아지는데, 이는 아마도 전신 염증 수준이 낮기 때문일 것입니다.

   올리브 포마스 오일은 용매 추출이나 원심분리를 통해 올리브 오일 생산의 고체 부산물로부터 얻습니다. 이 부산물의 저장 기간을 통해 버진 올리브 오일의 미량에서만 발견되는 생물학적 활성으로 인해 큰 관심을 끄는 과일 껍질과 나무 잎의 성분으로 오일을 농축할 수 있습니다. 따라서 원심분리된 올리브 포마스 오일은 지용성인 불비누화 분획의 성분이 풍부합니다. 이들 화합물의 일부는 정제 과정에서 손실되지만 온화한 정제 조건에서는 적절한 농도로 유지될 수 있습니다. 이러한 성분에는 스테롤과 토코페롤뿐만 아니라 올레아놀산과 마슬린산인 트리테르펜산도 포함됩니다.

   이전의 시험관 내 연구에서 연구자들은 올리브 포마스 오일 알파-토코페롤, 올레아놀산 및 베타-시토스테롤에 들어 있는 생리 활성 화합물이 단독으로나 인공 중성지방이 풍부한 지질단백질(TRL)의 일부로 소교세포 활성화를 약화시킬 수 있음을 입증했습니다. 소교세포 감쇠는 과잉 활성화를 초래하는 자극을 받을 때 세포에 의해 방출되는 염증 및 산화 스트레스의 다양한 마커를 측정하여 결정되었습니다. 이 발견은 이러한 생리활성 화합물이 뇌에 도달하면 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 발병을 예방하거나 늦추는 데 도움이 될 수 있다는 가능성을 열어주었습니다.

   그런 다음 연구자들은 올리브 포마스 오일 섭취 후 얻은 인간 TRL이 고올레산 해바라기 오일 섭취 후 얻은 것보다 소교세포 활성화를 더 크게 약화시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위해 비교 식후 연구를 수행했습니다. 연구자들은 식후 기간 중 특정 시점에 TRL로 처리된 소교세포에 의한 염증 및 산화 스트레스 지표의 방출이 올리브 포마스 오일 섭취에서 추출되었을 때 더 낮다는 것을 발견했습니다. 따라서 건강한 피험자의 경우 식후 포마스 오일을 섭취하면 생리 활성 화합물을 운반하는 지단백질이 생성되고 이것이 소교세포 활성화의 약화에 참여한다는 것이 입증되었습니다.

   결과적으로 연구자들은 기억 문제나 초기 인지 장애가 있는 알츠하이머병 진단을 받은 환자를 대상으로 우리의 가설을 테스트할 때가 왔다고 믿습니다. 이 프로젝트에서 연구자들은 이 환자들이 식후 지질 대사에 변화를 가져오며 TRL이 소교세포를 과도하게 활성화하는 능력이 더 커지게 되지만 포마스 오일을 섭취하면 이러한 활성화가 약화될 것이라는 가설을 세웠습니다. 만약 그렇다면, 포마스 오일을 섭취하면 소교세포의 과잉 활성화로 인한 신경염증을 예방하여 알츠하이머병 발병 및 진행 위험을 줄일 수 있음을 시사합니다.

2. 실제 가설

   이 프로젝트는 인공 및 인간 유래 TRL이 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환과 관련된 현상인 소교세포의 활성화를 유도할 수 있다는 입증을 기반으로 합니다. 또한, 올리브 포마스 오일과 그 생리 활성 화합물의 섭취는 이러한 활성화를 약화시킬 수 있는 것으로 나타났습니다. 이 연구 프로젝트의 접근 방식은 알츠하이머 환자가 올리브 포마스 오일을 섭취하면 이러한 생리 활성 화합물을 유지하고 소교세포 활성화 및 염증에 대한 보호 능력을 유지하는 식후 TRL이 형성된다는 것입니다.

   만약 그렇다면, 획득된 증거는 식후 기간에 형성된 TRL의 영향에 기초하고 알츠하이머병의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 포마스 오일의 새로운 건강 응용 개발을 위한 토대를 마련할 것입니다. 질병.

3. 목표

위의 가설을 테스트하기 위해 다음과 같은 구체적인 목표를 다룹니다.

1. 경증 또는 초기 단계로 진단된 알츠하이머병 환자의 식후 지질 대사에 가능한 변화를 확인합니다.
2. 포마스 오일 섭취가 고올레산 해바라기 오일과 비교하여 식후 지질 대사의 이러한 변화를 정상화할 수 있는지 여부를 평가합니다.
3. 포마스 오일 또는 고올레산 해바라기 오일 섭취 후 얻은 인간 TRL을 얻고 특성화합니다.
4. 고올레산 해바라기 오일과 비교하여 포마스 오일 섭취 후 얻은 TRL에 의한 소교세포 활성화의 감쇠 효과를 평가합니다.

4. 실험 설계 및 활동

이번 연구는 알츠하이머병 환자를 대상으로 한 무작위, 이중 맹검, 식후 교차 시험으로 설계되었으며, 이들은 무작위로 두 그룹으로 나누어 같은 연령의 건강한 대조군과 비교하게 됩니다. 모든 피험자에게는 포마스 오일과 고올레산 해바라기 오일이 제공됩니다.

활동 1. 생체 활성 화합물이 풍부한 찌꺼기 오일 얻기

올리브 포마스 오일은 ORIVA가 제공할 예정이며, 고올레산 해바라기 오일은 상업용으로 제공됩니다. 두 오일 모두 Instituto de la Grasa-CSIC에서 특성 분석을 통해 산 및 트리테르펜 알코올, 토코페롤 및 스테롤 함량을 결정합니다.

활동 2. 자원 봉사자 선정 및 실험용 오일 관리

하위 활동 2.1. 자원봉사자 선발

식후 임상시험은 헬싱키 선언, 유럽 평의회 협약 및 유네스코 세계 선언의 기본 원칙에 따라 수행되며 세비야에 있는 Virgen de Valme 병원의 신경과에서 진행될 예정입니다. 성인 지원자는 알츠하이머병 진단을 받은 사람들 중에서 표준 기준과 특정 바이오마커를 사용한 임상 및 인지 테스트 결과를 바탕으로 선정됩니다. 또한 포함 기준에는 적절한 시각 및 청각 능력과 의료 인력의 질병 진행에 대한 후속 기록이 포함됩니다. 제외 기준에는 임상적으로 중요한 정신 장애; 안전에 영향을 미칠 수 있는 전신 질환 또는 감염; 지난 2년 이내의 심혈관 질환; 지난 6개월 이내에 조절되지 않은 고혈압; 지난 5년 이내의 암; 지난 2년 이내에 약물 또는 알코올 남용; 및 인슐린 의존성 당뇨병.

참여를 위해 개인은 구두 및 서면으로 통보받은 후 Virgen de Valme 병원 윤리위원회가 승인한 프로토콜에 서면 동의해야 합니다. 재판 전날에는 알코올 음료와 담배 섭취를 피하도록 권장됩니다.

하위 활동 2.2. 표본 크기 결정. 본 연구에서 검토할 정량변수는 식후 혈장 중성지방 농도이다. 고올레산 해바라기유와 비교하여 올리브 포마스 오일 섭취로 인해 트리글리세리드 농도가 최소 10% 감소한다고 가정하고 연구 안전성을 95%(위험 α 0.05; zα 1.645) 및 90% 검정력으로 고려합니다. (zβ 1.282), 16명의 지원자의 표본 크기가 얻어졌습니다. 자원봉사자가 거부할 가능성이 있으므로(부작용은 예상되지 않지만) 표본 크기를 그룹당 20명으로 늘리는 것이 신중한 것으로 간주됩니다.

하위 활동 2.3. 실험 식사 투여 시험 당일과 12시간 동안 밤새 금식한 후 각 참가자는 팔뚝 정맥을 뚫어 혈액 샘플을 채취하게 됩니다. 그런 다음 포마스 올리브 오일이나 고올레산 해바라기 오일을 섭취하게 되며, 이를 커피나 우유, 통밀빵과 함께 토스트 등을 포함한 아침 식사의 일부로 먹게 됩니다. 섭취 후, 각 참가자는 식후 7시간 동안 매시간 혈액을 채취합니다. 이 기간 동안 물 섭취는 무료로 허용됩니다.

활동 3. 인간 트리글리세라이드가 풍부한 지질단백질(TRL)의 분리 및 특성 분석

하위 활동 3.1. 혈청 측정 얻은 큐비털 혈액에서 원심분리를 통해 혈청을 얻고 단백질 분해를 방지하기 위해 NaN3, PMSF 및 아프로티닌을 보존제로 첨가해야 합니다. 혈청은 분석될 때까지 -80°C에서 보관됩니다. 혈청에서 중성지방 농도는 분광광도법으로 측정하고 아포지단백질 B 농도는 면역비탁법으로 측정합니다. 이러한 측정을 통해 식후 TRL 형성 및 제거의 진행을 모니터링할 수 있습니다. 또한 올레아놀산, 알파-토코페롤, 베타-시토스테롤의 혈청 농도도 측정됩니다. 트리테르펜의 식별-정량화를 위해 우리 실험실에서 개발된 GC-MS 방법을 사용하여 분석 추출 및 분별 시스템을 따릅니다.

하위 활동 3.2. 트리글리세리드가 풍부한 지질단백질(TRL)의 분리 및 특성 규명 식후 분석에서 얻은 혈청의 초원심분리에 의해 분리된 TRL에 올레아놀산의 존재를 조사할 것입니다. 킬로미크론과 VLDL의 존재에 대한 지표인 지방산과 TG 함량, apo B48과 B100은 ELISA로 결정됩니다. 이러한 동일한 입자는 소교세포 활성화 연구(활동 4)에도 사용됩니다.

활동 4. 인간 TRL 처리된 BV-2 세포의 소교세포 활성화 이 활동에서는 마우스 세포주 BV-2가 소교세포 모델로 사용됩니다. 이 세포 유형은 10% 열 불활성화 FBS, 스트렙토마이신(100mg/ml) 및 페니실린(100IU/ml)이 보충된 DMEM 배지에서 100% 습도 및 5% CO2 조건에서 배양됩니다. 실험은 5% FBS 감소 배지에서 수행됩니다. 세포는 식후 분석에서 얻은 TRL로 처리됩니다. 치료는 24시간 동안 유지됩니다.

하위 활동 4.1. 인간 TRL이 세포 생존율에 미치는 영향 먼저, 세포 생존율은 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) 방법으로 측정한다. 24시간 동안 배양한 후, 세포를 5% FBS가 보충된 신선한 배지로 세척하고 TRL로 12, 24 및 36시간 동안 처리해야 합니다. 세포를 5% FBS가 보충된 신선한 배지로 세척하고 TRL로 12, 24 및 36시간 동안 처리해야 합니다. 그런 다음 MTT 솔루션을 추가해야 합니다. 생성된 포르마잔 침전물은 DMSO에 용해되고 세포 생존율은 490 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화됩니다.

하위 활동 4.2. ROS 생성 및 산화환원 활성에 대한 영향 세포막을 통해 확산되고 세포내 에스테라제에 의해 가수분해되어 비형광 DCFH를 형성하는 형광 프로브 2',7'-디클로로플루오레세인-디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 ROS의 세포 내 농도. ROS가 존재하면 DCFH는 빠르게 산화되어 형광성이 높은 디클로로플루오레세인(DCF)을 형성합니다. 방출된 형광의 강도(485 nm 여기, 825 nm 방출)는 ROS의 세포내 농도에 비례합니다.

총 글루타티온과 산화된 글루타티온은 GSH와 디티오니트로벤조산(DTNB)에 의해 형성된 복합체를 분광광도계로 모니터링하는 NADPH 의존 GSSG 환원효소 활성을 기반으로 하는 효소적 방법으로 측정됩니다.

하위 활동 4.3. 사이토카인 생산에 대한 인간 TRL의 효과 BV-2 세포는 식후 TRL로 처리될 것이며, 배양 상청액 중 염증 유발성 및 항염증성 사이토카인의 생산은 제조사의 프로토콜에 따라 상업용 ELISA 키트를 사용하여 결정될 것이다.

하위 활동 4.4. 사이토카인 유전자 발현에 대한 인간 TRL의 효과 BV-2 세포를 식후 TRL로 처리하고 mRNA를 분리할 것이다. 관심 있는 사이토카인의 유전자 발현을 결정하기 위해, 이 목적을 위해 설계된 프라이머를 사용하여 cDNA로 역전사한 후 실시간 PCR 기술을 사용할 것입니다.