慢性肺疾患の予防 (CLD - 予防研究)

背景 慢性肺疾患 (CLD) は、周産期肺損傷の最も一般的な合併症の 1 つであり、持続性肺機能不全、喘息様症状、BPCO などの長期後遺症を伴う全身状態を表します。 CLD は、高酸素症、非経口栄養、炎症、人工呼吸器などの出生後の危険因子に加え、母親の喫煙、絨毛膜羊膜炎、子宮内発育制限 (IUGR) などの多くの出生前危険因子を認識します。 子宮内で炎症にさらされると、新生児の免疫発達が変化し、胎児の肺が侵襲的な機械換気や超生理学的酸素に対する調節不全の長期反応を起こしやすくなります。 人生の早い段階での有害な（および保護的な）影響に対する反応は、遺伝的およびエピジェネティックなメカニズムによって調節されており、その結果、成人期に重大な影響を及ぼす永続的な構造変化が生じる可能性があります。 IUGRの妊娠は酸化ストレスの増加を特徴とし、IUGRの乳児は成人後に心血管疾患、メタボリックシンドローム、肺機能不全、慢性腎臓疾患や呼吸器疾患のリスクが高い。肺損傷の進行につながるメカニズムに関する知識は絶えず増加しているにもかかわらず、これまでのところ、CLD の予防につながる効果的な管理法は開発されていません。

目的

1. 生後 12 か月間の肺機能の重度の経過を予測できる潜在的なバイオマーカーを前向きに特定し、高リスク新生児を早期に特定するための新しいプロファイルを実現します。
2. 重度の肺機能不全および喘息の発症と相関する遺伝的差異の因果関係モデル（MiSeq Illumina プラットフォームによる）を検出します。
3. 最初の 12 か月間の肺機能不全の重症度と相関する、マイクロ RNA および抗炎症性サイトカインおよび炎症促進性サイトカインの変動 (MIP-1a、MCP-1、IL-8、TNF-a、IFN-g、IL-10) を検出します。生命の危険と喘息発症のリスク。

実験計画 これは多施設縦断研究であり、その主な目的は、周産期から始めて慢性肺疾患（CLD）発症の新たな高リスク新生児プロファイルを特定することです。 この目的を達成するために、すべての参加ユニットは、登録された母親に対して膣スワブ検査を実施し、出生時の胎盤と臍帯血、および登録されたすべての新生児の末梢血、気管支肺胞洗浄液（BALF）、胎便、および糞便のサンプルを収集します。 研究は出生前危険因子の評価から始まる。

出産後、胎盤は 10% 緩衝ホルマリンで固定されます。 その後、アムステルダム胎盤ワークショップグループのコンセンサスステートメントに従って、巨視的および顕微鏡的分析が実行されます。 登録された女性全員の出産時に膣綿棒が採取されます。 3 ml の臍帯血 (動脈および/または静脈) は、miRNA、遺伝的差異、およびサイトカインの分析のために実行されます。 挿管された乳児のみの場合、BALF サンプルは、気管内チューブに 1 ml/kg の 0.9% 塩化ナトリウムを注入し、その液体を滅菌粘液トラップに吸引することによって取得されます。 最初の BALF サンプルは生後 24 時間以内に採取されますが、まだ挿管されている新生児では生後 7 日目と 28 日目にさらなる BALF サンプルが採取されます。 出生後の最初の胎便サンプルと追加の糞便サンプルは、生後 7 日、28 日、生後 6 ヶ月、および 12 ヶ月で収集されます。 膣スワブ、胎盤、BALF、胎便、および糞便のサンプルは、さらに処理するまで -80°C で保存されます。 各サンプルについて、細菌 DNA 抽出は、厳密に管理されたレベル 2 の生物学的安全作業場で、DANAGENE MICROBIOME DNA キット (Danagen-Bioted) を使用してメーカーの指示に従って実行されます。

出生時（動脈）および生後 48 時間の臍帯血清において、8 ～ 10 個の候補 miRNA、特に miR-451、miR-29b、および miR-16 が研究されます。血管内皮増殖因子 (VEGF) 抑制と miR による血管新生は、CLD に対する遺伝的感受性に関連しています。 遺伝的差異因果関係モデルは、次世代シーケンス技術の適用を可能にする MiSeq Illumina プラットフォームを使用して、生後 48 時間の登録されたすべての新生児 (少なくとも 500 μL の全血) で実行されます。

経時的な疾患の重症度と相関する抗炎症性サイトカインおよび炎症促進性サイトカインの変動を検出するために、入院時（生後48時間以内）に対象の乳児から臍帯血および末梢血サンプル（EDTAチューブに2ml）を採取します。 、生後7日目と28日目、6か月と12か月のとき。 抗 (INF-γ) サイトカインと炎症誘発性 (IL-6 および NGF) サイトカインの両方のレベルが調査されます。 すべてのサンプルはテストまで -80 °C で保存されます。 サイトカインは、製造業者の指示に従って市販のELISAキットを使用して測定されます。

研究者らはまた、母親と胎盤のデータと、生後数日間の新生児の分析との関連性を調査しようとしている。 新生児集中治療室への新生児の入院時には、血液酸素化の程度と変化、さらに酸化ストレス（OS）およびOS関連疾患の原因となる感染症の存在を確認することにかなりの注意が払われます。 以下の検体が採取されます: 末梢血 1 ml (生後 48 時間以内)。 追加の末梢血サンプルは、生後 7 日目と 28 日目、生後 6 か月と 12 か月の時点で採取されます。

酸化ストレス（OS）およびOSに関与する脂質メディエーターは、酸化タンパク質損傷（Advanced Oxidation Protein Products、AOPP）および脂質過酸化（イソプロスタン、IsoP）のバイオマーカーの両方によって評価されます。 酸化ストレスプロファイルのさらなる評価は、非酵素的抗酸化分子（ビタミンE、グルタチオン、GSH、およびアスコルビン酸、AA）および酵素的抗酸化分子（スーパーオキシドジスムターゼ、SOD、カタラーゼ、CAT、およびグルタチオンペルオキシダーゼ、GPx）を測定することによって実行されます。 ）。 この目的のために、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) およびガスクロマトグラフィー連動型質量分析 (GC-MS) が使用されます。HPLC は、ビタミン E、グルタチオン、GSH、AA を検出します。

最後のステップでは、生後12か月までに重度の肺機能不全を起こし、その後の年齢で喘息やCOPDを発症するリスクが高い新生児の新たなプロファイルを前向きに特定することになる。 登録されたすべての乳児の長期転帰は、子宮内エクスポソーム（絨毛膜羊膜炎または胎児発育制限）の一部としての胎盤分析、miRNA発現、炎症および微生物叢と、出生後の炎症に伴う酸化ストレスとの関係を解明するために実施されます。要因（侵襲的呼吸補助、動脈管開存症、肺炎、敗血症） - 生後6か月および12か月の肺機能異常に関する肺転帰を伴う。

生後 6 か月と 12 か月の時点で、乳児は臨床的および肺の評価を受けます。 肺機能検査（PFT）は、登録されたすべての乳児に対して実施され、潮汐呼吸分析と窒素ウォッシュアウト検査が含まれます。 乳児は、米国胸部学会/欧州呼吸器学会の推奨に従って、静かで自然な睡眠中に仰臥位に置かれ、肺容積、肺血流量、機能的残気量、肺クリアランス指数 5% (LCI 5)、肺クリアランスの測定が行われます。指数 2.5% (LCI 2.5)、ピーク呼気流量/呼気時間比 (tPTEF/tE) までの時間。 肺の異常を除外するために肺超音波検査が行われます。 マスクに適応させた後、2 分を超える潮汐呼吸、流量ループ、または 20 回を超えるアーティファクトのない呼吸が記録されます。 PFT は、呼吸機能データを生成された生化学プロファイルのデータと関連付けるために行われます。 肺機能、出生直前および生後 6 ～ 12 か月の乳児の生化学マーカー、および身体測定値の間の考えられる関係が研究される予定です。 子宮外での生活中の肺の発達と機能は、出生前測定に関連します。 在胎週数（AGA）の乳児、在胎週数に対して小型（SGA）の乳児、在胎週数に対して大型（LGA）の乳児に適したデータが比較されます。

データ収集方法 画像、組織、血液サンプルから生成された定量的データ、定性的データなど、いくつかの種類のデータが収集されます。 目的 1、2、および 3 の臨床データは、UO1-Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/) でホストされる REDCap 電子データ キャプチャ ツールを使用して収集および管理されます。

専用の電子症例報告フォーム（eCRF）が開発されます。 疑似匿名化されたデータは、関係するユニットから収集されます。 治験責任医師は、eCRF が適切かつ完全に記入されていることを確認する責任を負います。 臨床情報のソースには、医師の患者記録、病院の記録、元の検査記録、薬局の記録、超音波検査の結果などが含まれます。

統計計画 研究の主要評価項目は、臨床、人口統計、臨床検査値、およびその他のパラメーターが、PMA 36 週時点での慢性肺疾患の発症および/または生後 12 か月時点での肺機能異常の発症を予測できるかどうかを特定することです。 ROC 曲線下面積が少なくとも 0.75 ± 0.15 である許容可能な精度レベルを仮定すると、42 人の患者のサンプル サイズが必要です。

統計分析 サンプルは、適切な記述統計指標を使用して、その臨床的および人口統計学的特徴において記述されます。 詳細には、定性的データは絶対頻度と相対頻度パーセントとして表され、量的変数はケースに応じて平均と標準偏差 (SD) または中央値と四分位範囲 (IQR) のいずれかとして表されます。 量的変数のガウス分布を検証するために、Shapiro-Wilk テストが適用されます。 ベースラインでのグループ間の差異は、必要に応じて、カイ二乗検定またはフィッシャー・フリーマン・ハルトンの正確検定のいずれかによって、定性データに関して評価されます。 量的データは、データ分布に応じて、独立したサンプルのスチューデントの t 検定またはマン ウィズニーのノンパラメトリック U 検定を使用して代わりに比較されます。 バイオリンプロットは、重要な差異または臨床的に関連する差異をグラフで表すために使用されます。 12か月後の主要転帰に関する差異の評価は、カプラン・マイヤー生存分析によって評価されます。 特に、ログランク検定が適用され、適切な累積発生率曲線が描画されます。 12 か月後の主要転帰の潜在的な予測因子を評価するために、単変数および多変数 Cox 回帰モデルが適合されます。 詳細には、結果の潜在的な予測因子が通常の比例ハザード Cox 回帰モデルによって評価され、その結果としてハザード比 (HR) と 95% 信頼区間 (CI) が報告されます。 ハザード関数の比例性は、ハザードとシェーンフェルト残差プロットの目視検査によって評価されます。 比例性に疑問がある場合は、Cox 加重回帰モデルが適合されます。 多変量モデルに含まれる予測因子は、単変量分析 (p<0.05 または示唆的、つまり 0.05 p <0.10) と、結果変数ごとに少なくとも 10 件のイベントのルールと一致する専門家の意見、および TRIPOD 推奨に基づいて選択されます。 モデルのパフォーマンスは、Cindex、Somers Dxy ランク相関、Nagelkerke の R2 値、キャリブレーション切片、スロップなどのいくつかの指標によって評価されます。 C インデックスは、AUC、つまりモデルの精度の尺度として解釈できます。 統計的有意性は、p<0.05 の値に設定されます。 示唆的な p 値 (0.05、p < 0.10) も報告されます。 統計分析は、STATA (StataCorp、米国) および R (https://www.r-project.org/) を使用して実行されます。