Prävention chronischer Lungenerkrankungen (CLD – Präventionsstudie)

Hintergrund Die chronische Lungenerkrankung (CLD) ist eine der häufigsten Komplikationen einer perinatalen Lungenschädigung und stellt eine systemische Erkrankung mit Langzeitfolgen wie anhaltender Lungenfunktionsstörung, asthmaähnlichen Symptomen und BPCO dar. CLD berücksichtigt neben postnatalen Risikofaktoren wie Hyperoxie, parenteraler Ernährung, Entzündung und mechanischer Beatmung viele pränatale Risikofaktoren, darunter mütterliches Rauchen, Chorioamnionitis und intrauterine Wachstumsrestriktion (IUGR). Die Exposition gegenüber Entzündungen in der Gebärmutter verändert die Immunentwicklung des Neugeborenen und prädisponiert die fetale Lunge für eine fehlregulierte verlängerte Reaktion auf invasive mechanische Beatmung und supraphysiologischen Sauerstoff. Reaktionen auf schädliche (und schützende) Einflüsse im frühen Lebensalter werden durch genetische und epigenetische Mechanismen moduliert, die zu dauerhaften strukturellen Veränderungen mit erheblichen Folgen im Erwachsenenalter führen können. IUGR-Schwangerschaften sind durch erhöhten oxidativen Stress gekennzeichnet und IUGR-Säuglinge haben ein hohes Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, metabolisches Syndrom, Lungenfunktionsstörungen und chronische Nieren- und Atemwegserkrankungen im Erwachsenenalter. Trotz des ständig wachsenden Wissens über die Mechanismen, die zum Fortschreiten von Lungenschäden führen, so Bisher wurde kein wirksames Management entwickelt, das zur CLD-Prävention führen würde.

Ziele

1. Identifizieren Sie prospektiv potenzielle Biomarker, die den schweren Verlauf der Lungenfunktion in den ersten 12 Lebensmonaten vorhersagen können, und erstellen Sie ein neues Profil zur Früherkennung von Hochrisiko-Neugeborenen.
2. Erkennen Sie ein genetisches Varianz-Ursachenmodell (von der MiSeq Illumina-Plattform), das mit schwerer Lungenfunktionsstörung und Asthmaentwicklung korreliert.
3. Erkennen Sie MicroRNAs sowie anti- und proinflammatorische Zytokinvariationen (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10), die mit der Schwere der Lungenfunktionsstörung in den ersten 12 Monaten korrelieren des Lebens und das Risiko der Entwicklung von Asthma.

Experimentelles Design Hierbei handelt es sich um eine multizentrische Längsschnittstudie, deren Hauptziel darin besteht, ein neues Hochrisiko-Neugeborenenprofil für die Entwicklung einer chronischen Lungenerkrankung (CLD) zu identifizieren, beginnend mit dem perinatalen Leben. Um dieses Ziel zu erreichen, führen alle teilnehmenden Einheiten einen Vaginalabstrich bei den eingeschriebenen Müttern durch und sammeln Plazenta- und Nabelschnurblut bei der Geburt sowie peripheres Blut, bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF), Mekonium und Kotproben aller eingeschriebenen Neugeborenen. Die Studie beginnt mit der Bewertung pränataler Risikofaktoren.

Nach der Entbindung werden die Plazenten in 10 % gepuffertem Formalin fixiert. Anschließend werden makroskopische und mikroskopische Analysen gemäß der Konsenserklärung der Amsterdamer Plazenta-Workshop-Gruppe durchgeführt. Bei allen eingeschriebenen Frauen wird zum Zeitpunkt der Entbindung ein Vaginalabstrich entnommen. Zur Analyse von miRNA, genetischer Varianz und Zytokinen werden drei ml Nabelschnurblut (Arterie und/oder Vene) entnommen. Nur bei intubierten Säuglingen wird die BALF-Probe durch Einträufeln von 1 ml/kg 0,9 % Natriumchlorid in den Endotrachealtubus und Absaugen der Flüssigkeit in eine sterile Schleimfalle gewonnen. Die erste BALF-Probe wird innerhalb der ersten 24 Lebensstunden entnommen, weitere BALF-Proben werden am 7. und 28. Lebenstag bei Neugeborenen entnommen, die noch intubiert sind. Die erste Mekoniumprobe nach der Geburt und weitere Kotproben werden am 7., 28. Lebenstag, 6. und 12. Lebensmonat entnommen. Vaginalabstriche, Plazenta-, BALF-, Mekonium- und Kotproben werden bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C gelagert. Für jede Probe wird die bakterielle DNA-Extraktion an einem streng kontrollierten biologischen Sicherheitsarbeitsplatz der Stufe 2 unter Verwendung von DANAGENE MICROBIOME DNA-Kits (Danagen-Bioted) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Im Nabelschnurserum bei der Geburt (Arterie) und nach 48 Lebensstunden werden 8–10 mögliche miRNAs, insbesondere miR-451, miR-29b und miR-16, untersucht, da gezeigt wurde, dass sie eine hemmende Wirkung haben Angiogenese durch Unterdrückung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) und miR ist mit der genetischen Anfälligkeit für CLD verbunden. Das genetische Varianz-Ursachenmodell wird bei allen eingeschriebenen Neugeborenen im Alter von 48 Stunden (mindestens 500 μl Vollblut) mithilfe einer MiSeq Illumina-Plattform durchgeführt, die die Anwendung von Next-Generation-Sequencing-Technologien ermöglicht.

Um anti- und proinflammatorische Zytokinvariationen zu erkennen, die mit der Schwere der Erkrankung im Laufe der Zeit korrelieren, werden den eingeschlossenen Säuglingen bei der Aufnahme (innerhalb von 48 Stunden nach dem Leben) Nabelschnurblut- und periphere Blutproben (2 ml in ein EDTA-Röhrchen) entnommen. , am 7. und 28. Lebenstag, im 6. und 12. Lebensmonat. Es werden sowohl anti- (INF-y) als auch proinflammatorische (IL-6 und NGF) Zytokinspiegel untersucht. Alle Proben werden bis zum Test bei -80 °C gelagert. Zytokine werden mit einem kommerziell erhältlichen ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Die Forscher werden auch versuchen, den Zusammenhang zwischen Mutter- und Plazentadaten mit der Analyse von Neugeborenen in den ersten Lebenstagen zu untersuchen. Bei der Aufnahme von Neugeborenen auf die Intensivstation für Neugeborene wird besonderes Augenmerk auf die Feststellung des Ausmaßes und der Schwankungen der Hämoxygenierung sowie auf das Vorliegen einer Infektion gelegt, die die Ursache für oxidativen Stress (OS) und OS-bedingte Erkrankungen ist. Folgende Proben werden entnommen: 1 ml peripheres Blut (innerhalb von 48 Lebensstunden). Zusätzliche periphere Blutproben werden am 7. und 28. Lebenstag sowie im 6. und 12. Lebensmonat entnommen.

Oxidativer Stress (OS) und an OS beteiligte Lipidmediatoren werden sowohl anhand von Biomarkern für oxidativen Proteinschaden (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) als auch für Lipidperoxidation (Isoprostane, IsoPs) bewertet. Eine weitere Bewertung des oxidativen Stressprofils wird durch Messung nichtenzymatischer Antioxidansmoleküle (Vitamin E; Glutathion, GSH und Ascorbinsäure, AA) und enzymatischer Antioxidansmoleküle (Superoxiddismutase, SOD, Katalase, CAT und Glutathionperoxidase, GPx) durchgeführt ). Zu diesem Zweck werden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Gaschromatographie-Schnittstellenmassenspektrometrie (GC-MS) eingesetzt: HPLC zum Nachweis von Vitamin E, Glutathion, GSH und AA.

Im letzten Schritt wird prospektiv ein neues Profil von Neugeborenen mit hohem Risiko für schwere Lungenfunktionsstörungen in den ersten 12 Lebensmonaten und einem höheren Risiko für die Entwicklung von Asthma und COPD im späteren Alter ermittelt. Bei allen eingeschriebenen Babys wird eine Langzeituntersuchung durchgeführt, um die Zusammenhänge zwischen Plazentaanalyse, miRNA-Expression, Entzündung und Mikrobiota – als Teil des In-utero-Exposoms (Chorioamnionitis oder fetale Wachstumsbeschränkung) und oxidativem Stress mit Entzündung – als Teil der postnatalen Entwicklung aufzuklären Faktoren (invasive Atemunterstützung, offener Ductus arteriosus, Lungenentzündung, Sepsis) - mit dem pulmonalen Ergebnis in Form einer abnormalen Lungenfunktion im Alter von 6 und 12 Monaten.

Im Alter von 6 und 12 Monaten werden die Säuglinge klinisch und pulmonal untersucht. Bei allen eingeschriebenen Säuglingen wird ein Lungenfunktionstest (PFT) durchgeführt, der eine Gezeitenatmungsanalyse und einen Stickstoff-Auswaschtest umfasst. Die Säuglinge werden in ruhiger, natürlicher Schlaflage in Rückenlage gebracht, gemäß den Empfehlungen der American Thoracic Society/European Respiratory Society mit Messung des Lungenvolumens, des Flusses, der funktionellen Residualkapazität, des Lung Clearence Index 5 % (LCI 5) und der Lung Clearence Index 2,5 % (LCI 2,5), Zeit bis zum Höhepunkt des exspiratorischen Gezeitenflusses/Exspirationszeit-Verhältnis (tPTEF/tE). Um Lungenanomalien auszuschließen, wird eine Lungenultraschalluntersuchung durchgeführt. Nachdem die Anpassung an die Maske ermöglicht wurde, werden Ruheatmung, Flussvolumenschleifen für >2 Minuten oder >20 artefaktfreie Atemzüge aufgezeichnet. Es wird eine PFT durchgeführt, um die funktionellen Atmungsdaten mit denen des generierten biochemischen Profils in Beziehung zu setzen. Mögliche Zusammenhänge zwischen Lungenfunktion, biochemischen Markern kurz vor der Geburt und bei Säuglingen im Alter von 6 bis 12 Monaten sowie anthropometrischen Messungen werden untersucht. Die Lungenentwicklung und -funktion während des extrauterinen Lebens wird mit pränatalen Messungen in Zusammenhang gebracht. Es werden Daten für Säuglinge im Gestationsalter (AGA), für Säuglinge im Gestationsalter (SGA) und für Säuglinge im Gestationsalter (LGA) verglichen.

Methoden der Datenerfassung Es werden verschiedene Arten von Daten erfasst, darunter quantitative und qualitative Daten, die aus Bildgebungs-, Gewebe- und Blutproben generiert werden. Klinische Daten für die Ziele 1, 2 und 3 werden mithilfe der elektronischen Datenerfassungstools von REDCap gesammelt und verwaltet, die an der UO1-Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/) gehostet werden.

Es wird ein spezielles elektronisches Fallberichtsformular (eCRF) entwickelt. Von den beteiligten Einheiten werden pseudoanonymisierte Daten erhoben. Der Prüfer ist dafür verantwortlich, dass das eCRF ordnungsgemäß und vollständig ausgefüllt wird. Zu den Quellen klinischer Informationen gehören die Patientenakte des Arztes, Krankenhausnotizen, Original-Laborunterlagen, Apothekenunterlagen, Ergebnisse von Ultraschalluntersuchungen usw.

Statistischer Plan Primärer Endpunkt der Studie ist die Feststellung, ob klinische, demografische, Labor- und andere Parameter in der Lage sind, die Entwicklung einer chronischen Lungenerkrankung in der 36. Woche der PMA und/oder einer abnormalen Lungenfunktion im Alter von 12 Monaten vorherzusagen. Unter der Annahme einer akzeptablen Genauigkeit mit einer Fläche unter der ROC-Kurve von mindestens 0,75 ± 0,15 ist eine Stichprobengröße von 42 Patienten erforderlich.

Statistische Analyse Die Stichprobe wird in ihren klinischen und demografischen Merkmalen anhand der entsprechenden deskriptiven Statistikindizes beschrieben. Im Detail werden qualitative Daten als absolute und relative prozentuale Häufigkeit ausgedrückt, während quantitative Variablen je nach Fall entweder als Mittelwert und Standardabweichung (SD) oder als Median und Interquartilbereich (IQR) ausgedrückt werden. Um die Gaußsche Verteilung quantitativer Variablen zu überprüfen, wird der Shapiro-Wilk-Test angewendet. Unterschiede zwischen den Gruppen zu Studienbeginn werden im Hinblick auf qualitative Daten je nach Bedarf entweder mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem exakten Fisher-Freeman-Haltons-Test bewertet. Quantitative Daten werden stattdessen je nach Datenverteilung mithilfe des Student-t-Tests für unabhängige Stichproben oder des nichtparametrischen U-Tests von Mann Withney verglichen. Violinplots werden verwendet, um signifikante oder klinisch relevante Unterschiede grafisch darzustellen. Die Bewertung des Unterschieds hinsichtlich des primären Ergebnisses nach 12 Monaten wird durch eine Kaplan-Meier-Überlebensanalyse ausgewertet. Insbesondere wird der Log-Rank-Test angewendet und entsprechende kumulative Inzidenzkurven erstellt. Um potenzielle Prädiktoren für das primäre Ergebnis nach 12 Monaten zu bewerten, werden uni- und multivariable Cox-Regressionsmodelle angepasst. Im Detail werden die potenziellen Prädiktoren des Ergebnisses mithilfe herkömmlicher proportionaler Hazard-Cox-Regressionsmodelle bewertet und anschließend die Hazard Ratios (HR) und die 95 %-Konfidenzintervalle (CIs) gemeldet. Die Proportionalität der Gefahrenfunktionen wird durch visuelle Inspektion der Gefahren und Schönfeld-Residuendiagramme bewertet. Bei Zweifeln an der Verhältnismäßigkeit werden Cox-gewichtete Regressionsmodelle angepasst. Prädiktoren, die in das multivariable Modell einbezogen werden sollen, werden auf der Grundlage der univariablen Analyse (p < 0,05 oder suggestiv, d. h. 0,05 p < 0,10) und der Expertenmeinung, im Einklang mit der Regel von mindestens 10 Ereignissen pro Ergebnisvariable und den TRIPOD-Empfehlungen ausgewählt. Die Leistung des Modells wird anhand mehrerer Indizes bewertet, wie z. B. Cindex, Somers Dxy-Rank-Korrelation, Nagelkerkes R2-Wert, Kalibrierungsabschnitt und Slop. Der C-Index kann als AUC interpretiert werden, also als Maß für die Genauigkeit des Modells. Statistische Signifikanz wird für Werte von p<0,05 angenommen. Suggestive p-Werte (0,05, p < 0,10) werden ebenfalls gemeldet. Statistische Analysen werden mit STATA (StataCorp, USA) und R (https://www.r-project.org/) durchgeführt.