Forebygging av kronisk lungesykdom (CLD - Prevention Study)

Bakgrunn Kronisk lungesykdom (CLD) er en av de vanligste komplikasjonene ved perinatal lungeskade som representerer en systemisk tilstand med langvarige følgetilstander, som vedvarende lungedysfunksjon, astma-lignende symptomer og BPCO. CLD gjenkjenner mange prenatale risikofaktorer, inkludert mors røyking, chorioamnionitt og intrauterin vekstbegrensning (IUGR), i tillegg til postnatale risikofaktorer som hyperoksi, parenteral ernæring, betennelse og mekanisk ventilasjon. Eksponering for betennelse in utero endrer neonatal immunutvikling og disponerer fosterlungen for en dysregulert langvarig respons på invasiv mekanisk ventilasjon og suprafysiologisk oksygen. Respons på skadelige (og beskyttende) påvirkninger tidlig i livet moduleres av genetiske og epigenetiske mekanismer, som kan resultere i permanente strukturelle endringer med betydelige konsekvenser i voksen alder. IUGR-svangerskap er preget av økt oksidativt stress og IUGR-spedbarn har høy risiko for hjerte- og karsykdommer, metabolsk syndrom, lungedysfunksjon og kroniske nyre- og luftveissykdommer i voksen alder. Til tross for den konstante økningen i kunnskap om mekanismene som fører til progresjon av lungeskade, så langt er det ikke utviklet noen effektiv behandling som kan føre til CLD-forebygging.

Mål

1. identifisere potensielle biomarkører i stand til å forutsi det alvorlige forløpet av lungefunksjon i de første 12 månedene av livet og realisere en ny profil for tidlig å identifisere nyfødte med høy risiko.
2. oppdage genetisk varians årsaksmodell (av MiSeq Illumina-plattformen) som korrelerer med alvorlig lungedysfunksjon og astmautvikling.
3. oppdage mikroRNA så vel som anti- og pro-inflammatoriske cytokinvariasjoner (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) som korrelerer med alvorlighetsgraden av lungedysfunksjon i de første 12 månedene av livet og risikoen for astmautvikling.

Eksperimentell design Dette er en multisenter longitudinell studie, hvis primære mål er å identifisere en ny høyrisiko neonatal profil for utvikling av kronisk lungesykdom (CLD), med utgangspunkt i perinatalt liv. For å nå dette målet vil alle deltakerenhetene utføre vaginal vattpinne til de registrerte mødrene, samle inn placenta- og navlestrengsblod ved fødselen og perifert blod, bronkoalveolær lavagevæske (BALF), mekonium og avføringsprøver fra alle påmeldte nyfødte spedbarn. Studien vil begynne med evaluering av prenatale risikofaktorer.

Etter levering vil morkakene fikseres i 10 % bufret formalin. Deretter vil makroskopiske og mikroskopiske analyser bli utført i henhold til konsensuserklæringen fra Amsterdam placental workshop group. En vaginal vattpinne vil bli samlet inn ved leveringstidspunktet for alle påmeldte kvinner. Tre ml navlestrengsblod (arterie og/eller vene) vil bli utført for analyse av miRNA, genetisk varians og cytokiner. Kun hos intuberte spedbarn vil BALF-prøven fås ved å instillere 1 ml/kg 0,9 % natriumklorid i endotrakealrøret og suge væsken inn i en steril slimfelle. Den første BALF-prøven vil bli tatt i løpet av de første 24 timene av livet, mens ytterligere BALF-prøver vil bli samlet inn ved 7 og 28 dager av livet hos nyfødte som fortsatt vil være intubert. Første mekoniumprøve etter fødsel og ytterligere avføringsprøver vil bli tatt etter 7, 28 levedager, 6 og 12 måneder av livet. Vaginale vattpinner, placenta, BALF, mekonium og avføringsprøver vil bli lagret ved -80°C inntil videre behandling. For hver prøve vil bakteriell DNA-ekstraksjon bli utført på en strengt kontrollert nivå-2 biologisk sikkerhetsarbeidsplass ved bruk av DANAGENE MICROBIOME DNA-sett (Danagen-Bioted) i henhold til produsentens instruksjoner.

I navlestrengsserum ved fødsel (arterie) og ved 48 levetimer vil 8-10 kandidatmiRNA, spesielt miR-451, miR-29b og miR-16 bli studert da det er vist at de har en hemmende effekt på angiogenese gjennom vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) undertrykkelse og miR er assosiert med genetisk følsomhet for CLD. Årsaksmodellen for genetisk variasjon vil bli utført i alle registrerte nyfødte etter 48 timers levetid (minst 500 μL fullblod) ved å bruke en MiSeq Illumina-plattform som tillater bruk av neste generasjons sekvenseringsteknologi.

For å oppdage anti- og pro-inflammatoriske cytokinvariasjoner som korrelerer med alvorlighetsgraden av sykdommen over tid, vil navlestrengsblod og perifere blodprøver (2 ml i et EDTA-rør) tas fra de inkluderte spedbarnene ved innleggelsen (innen 48 timer etter livet) , ved 7 og 28 dager av livet, ved 6 og 12 måneder. Både anti- (INF-y) og pro-inflammatoriske (IL-6 og NGF) cytokinnivåer vil bli undersøkt. Alle prøver vil bli lagret ved -80 °C frem til testing. Cytokiner vil bli målt med et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjoner.

Etterforskerne vil også prøve å utforske sammenhengen mellom mor og morkakedata med nyfødtanalyse i løpet av de første dagene av livet. Ved innleggelse av nyfødte på neonatal intensivavdeling vil det bli lagt stor vekt på å fastslå graden og variasjonene i hemo-oksygenering, samt tilstedeværelsen av infeksjon som er årsaken til oksidativt stress (OS) og OS-relaterte sykdommer. Følgende prøver vil bli tatt: 1 ml perifert blod (innen 48 timer etter livet). Ytterligere perifere blodprøver vil bli tatt etter 7 og 28 dager av livet, ved 6 og 12 måneder av livet.

Oksidativt stress (OS) og lipidmediatorer involvert i OS vil bli evaluert både av biomarkører for oksidativ proteinskade (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) og lipidperoksidasjon (Isoprostanes, IsoPs). En ytterligere evaluering av oksidativt stressprofil vil bli utført ved å måle ikke-enzymatiske antioksidantmolekyler (vitamin E; glutation, GSH og askorbinsyre, AA) og enzymatiske antioksidantmolekyler (superoksiddismutase, SOD, katalase, CAT og glutationperoksidase, GPx ). For dette formål vil høyytelses væskekromatografi (HPLC) og gasskromatografi-grensesnittbasert massespektrometri (GC-MS) bli brukt: HPLC for å påvise vitamin E, glutation, GSH og AA.

Det siste trinnet vil være prospektivt å identifisere en ny profil av nyfødte med høy risiko for alvorlig lungedysfunksjon i de første 12 månedene av livet, med høyere risiko for å utvikle astma og KOLS i senere alder. Et langsiktig resultat av alle påmeldte babyer vil bli utført for å avdekke forholdet mellom morkakeanalyse, miRNA-ekspresjon, betennelse og mikrobiota - som en del av in utero-eksposomet (chorioamnionitt eller fostervekstbegrensning) og oksidativt stress med betennelse - som en del av postnatal faktorer (invasiv respirasjonsstøtte, Patent Ductus Arteriosus, lungebetennelse, sepsis) - med lungeutfallet i form av unormal lungefunksjon ved 6 og 12 måneders alder.

Ved 6 og 12 måneders alder vil spedbarnene få klinisk og pulmonal utredning. Lungefunksjonstest (PFT) vil bli utført hos alle registrerte spedbarn og vil inkludere tidal pusteanalyse og Nitrogen Washout-test. Spedbarnene vil bli plassert i ryggleie, under rolig, naturlig søvn, i henhold til anbefalinger fra American Thoracic Society/European Respiratory Society med måling av lungevolum, flyt, funksjonell restkapasitet, Lung Clearence Index 5 % (LCI 5), Lung Clearence Indeks 2,5 % (LCI 2,5), tid til topp tidal ekspiratorisk strømning/ekspirasjonstidsforhold (tPTEF/tE). Lungeultralyd vil bli utført for å utelukke lungeavvik. Etter å ha tillatt tilpasning til masken, vil tidevannspusting, strømningsvolumløkker i >2 minutter eller >20 artefaktfrie pust bli registrert. PFT vil bli laget for å relatere de funksjonelle respirasjonsdataene med de av generert biokjemisk profil. Eventuelle sammenhenger mellom lungefunksjon, biokjemiske markører like før fødsel og hos spedbarn ved 6-12 måneders alder, og antropometriske målinger vil bli studert. Lungeutvikling og funksjon under ekstrauterint liv vil være relatert til prenatale målinger. Data som passer for spedbarn i svangerskapsalder (AGA), små for spedbarn i svangerskapsalder (SGA) og store for spedbarn i svangerskapsalder (LGA) vil bli sammenlignet.

Metoder for datainnsamling Flere typer data vil bli samlet inn, inkludert kvantitative, kvalitative, generert fra avbildning, vev og blodprøver. Kliniske data for mål 1, 2 og 3 vil bli samlet inn og administrert ved hjelp av REDCap elektroniske datafangstverktøy som er vert for UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Et dedikert elektronisk saksrapportskjema (eCRF) vil bli utviklet. Pseudo-anonimiserte data vil bli samlet inn fra de involverte enhetene. Etterforskeren vil være ansvarlig for å sikre at eCRF er riktig og fullstendig utfylt. Kilder til klinisk informasjon inkluderer legenes pasientjournal, sykehusnotater, originale laboratoriejournaler, apotekjournaler, resultater av ultralydundersøkelse etc.

Statistisk plan Primært endepunkt for studien er å identifisere om kliniske, demografiske, laboratorie- og andre parametere er i stand til å forutsi utviklingen av kronisk lungesykdom ved 36 uker med PMA og/eller av unormal lungefunksjon ved 12 måneders alder. Forutsatt et akseptabelt nøyaktighetsnivå, med et område under ROC-kurven på minst 0,75 ± 0,15, kreves en prøvestørrelse på 42 pasienter.

Statistisk analyse Prøven vil bli beskrevet i dens kliniske og demografiske karakteristika ved bruk av passende beskrivende statistikkindekser. I dybden vil kvalitative data uttrykkes som absolutt og relativ prosentvis frekvens, mens kvantitative variabler som enten gjennomsnitt og standardavvik (SD) eller median og interkvartilt område (IQR), avhengig av tilfelle. For å verifisere den Gaussiske fordelingen av kvantitative variabler vil Shapiro-Wilk-testen bli brukt. Forskjeller mellom grupper ved baseline vil bli evaluert, med hensyn til kvalitative data, ved enten Chi-Squared-testen eller Fisher-Freeman-Haltons eksakte test, etter behov. Kvantitative data vil i stedet sammenlignes ved å bruke Students t-test for uavhengige prøver eller Mann Withneys ikke-parametriske U-test, avhengig av datafordelingen. Fiolinplott vil bli brukt for å grafisk representere signifikante eller klinisk relevante forskjeller. Evalueringen av forskjellen når det gjelder primært utfall ved 12 måneder vil bli evaluert ved Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Spesielt vil log-rank test bli brukt, og passende kumulative insidenskurver vil bli tegnet. For å vurdere potensielle prediktorer for det primære utfallet etter 12 måneder, vil uni- og multivariable Cox-regresjonsmodeller bli tilpasset. I dybden vil de potensielle prediktorene for utfallet bli evaluert ved hjelp av vanlige proporsjonal hazard Cox regresjonsmodeller, og Hazard Ratios (HR) og 95 % konfidensintervallene (CIs) vil følgelig bli rapportert. Proporsjonaliteten til farefunksjonene vil bli evaluert ved visuell inspeksjon av farene og Schoenfeld-rester. Ved tvilsom proporsjonalitet vil Cox-vektede regresjonsmodeller bli montert. Prediktorer som skal inkluderes i den multivariable modellen vil bli valgt basert på den univariable analysen (p<0,05 eller suggestiv, dvs. 0,05 p <0,10) og ekspertuttalelser, i samsvar med regelen om minst 10 hendelser etter utfallsvariabel, og TRIPOD-anbefalinger. Ytelsen til modellen vil bli evaluert av flere indekser, som Cindex, Somers Dxy-rank korrelasjon, Nagelkerkes R2 verdi, kalibreringsavskjæring og slop. C-indeksen kan tolkes som en AUC, det vil si et mål på nøyaktigheten til modellen. Statistisk signifikans er satt for verdier på p<0,05. Suggestive p-verdier (0,05, p < 0,10) vil også bli rapportert. Statistiske analyser vil bli utført ved hjelp av STATA (StataCorp, USA) og R (https://www.r-project.org/).