Prevenção de Doença Pulmonar Crônica (CLD - Estudo de Prevenção)

Antecedentes A doença pulmonar crônica (DPC) é uma das complicações mais comuns da lesão pulmonar perinatal, que representa uma condição sistêmica com sequelas de longo prazo, como disfunção pulmonar persistente, sintomas semelhantes aos da asma e BPCO. A CLD reconhece muitos fatores de risco pré-natais, incluindo tabagismo materno, corioamnionite e restrição de crescimento intrauterino (RCIU), além de fatores de risco pós-natais, como hiperóxia, nutrição parenteral, inflamação e ventilação mecânica. A exposição à inflamação no útero altera o desenvolvimento imunológico neonatal e predispõe o pulmão fetal a uma resposta prolongada desregulada à ventilação mecânica invasiva e ao oxigênio suprafisiológico. As respostas a influências prejudiciais (e protetoras) no início da vida são moduladas por mecanismos genéticos e epigenéticos, que podem resultar em mudanças estruturais permanentes com consequências significativas na idade adulta. As gestações com RCIU são caracterizadas por aumento do estresse oxidativo e os bebês com RCIU apresentam alto risco de doenças cardiovasculares, síndrome metabólica, disfunção pulmonar e doenças renais e respiratórias crônicas na idade adulta. até agora, não foi desenvolvida qualquer gestão eficaz que conduzisse à prevenção da CLD.

Mira

1. identificar prospectivamente potenciais biomarcadores capazes de prever o curso grave da função pulmonar nos primeiros 12 meses de vida e realizar um novo perfil para identificar precocemente recém-nascidos de alto risco.
2. detectar modelo de causalidade de variação genética (pela plataforma MiSeq Illumina) correlacionado com disfunção pulmonar grave e desenvolvimento de asma.
3. detectar MicroRNAs, bem como variações de citocinas anti e pró-inflamatórias (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) correlacionadas com a gravidade da disfunção pulmonar nos primeiros 12 meses de vida e o risco de desenvolvimento de asma.

Desenho experimental Trata-se de um estudo longitudinal multicêntrico, cujo objetivo principal é identificar um novo perfil neonatal de alto risco para o desenvolvimento de Doença Pulmonar Crônica (DPC), a partir da vida perinatal. Para atingir este objetivo, todas as Unidades participantes realizarão esfregaço vaginal nas mães inscritas, coletarão amostras de placenta e sangue do cordão umbilical no nascimento e sangue periférico, líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), mecônio e fezes de todos os recém-nascidos inscritos. O estudo começará com a avaliação dos fatores de risco pré-natais.

Após o parto, as placentas serão fixadas em formalina tamponada a 10%. Posteriormente, análises macroscópicas e microscópicas serão realizadas de acordo com a declaração de consenso do grupo de workshop placentário de Amsterdã. Um esfregaço vaginal será coletado no momento do parto para todas as mulheres inscritas. Serão realizados três ml de sangue do cordão umbilical (artéria e/ou veia) para análise de miRNA, variância genética e citocinas. Apenas em bebês intubados, a amostra de LBA será obtida instilando 1 ml/kg de cloreto de sódio a 0,9% no tubo endotraqueal e aspirando o fluido em uma armadilha de muco estéril. A primeira amostra de LBA será coletada nas primeiras 24 horas de vida, enquanto outras amostras de LBA serão coletadas aos 7 e 28 dias de vida em recém-nascidos que ainda estarão intubados. A primeira amostra de mecônio após o nascimento e amostras adicionais de fezes serão coletadas aos 7, 28 dias de vida, 6 e 12 meses de vida. Amostras de esfregaços vaginais, placenta, LBA, mecônio e fezes serão armazenadas a -80°C até processamento posterior. Para cada amostra, a extração de DNA bacteriano será realizada em um local de trabalho de segurança biológica de nível 2 estritamente controlado usando kits DANAGENE MICROBIOME DNA (Danagen-Bioted) de acordo com as instruções do fabricante.

No soro do cordão umbilical ao nascimento (artéria) e às 48 horas de vida, serão estudados 8-10 miRNAs candidatos, em particular miR-451, miR-29b e miR-16, pois foi demonstrado que eles têm um efeito inibitório sobre angiogênese através da supressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e miR está associada à suscetibilidade genética à CLD. O modelo de causalidade da variância genética será realizado em todos os recém-nascidos inscritos com 48 horas de vida (pelo menos 500 μL de sangue total) usando uma plataforma MiSeq Illumina permitindo a aplicação de tecnologias de sequenciamento de próxima geração.

Para detectar variações de citocinas anti e pró-inflamatórias correlacionadas com a gravidade da doença ao longo do tempo, amostras de sangue do cordão umbilical e de sangue periférico (2 ml em um tubo de EDTA) serão obtidas dos bebês incluídos na admissão (dentro de 48 horas de vida) , aos 7 e 28 dias de vida, aos 6 e 12 meses. Os níveis de citocinas anti- (INF-y) e pró-inflamatórias (IL-6 e NGF) serão investigados. Todas as amostras serão armazenadas a -80 °C até o teste. As citocinas serão medidas com um kit ELISA disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.

Os investigadores também tentarão explorar a associação entre os dados da mãe e da placenta com a análise dos recém-nascidos durante os primeiros dias de vida. Na admissão do recém-nascido na Unidade de Terapia Intensiva Neonatal, considerável atenção será dada à verificação do grau e das variações da hemo-oxigenação, bem como da presença de infecção que está na origem do Estresse Oxidativo (EO) e de doenças relacionadas ao EO. Serão coletadas as seguintes amostras: 1 ml de sangue periférico (até 48 horas de vida). Amostras adicionais de sangue periférico serão coletadas aos 7 e 28 dias de vida, aos 6 e 12 meses de vida.

O estresse oxidativo (EO) e os mediadores lipídicos envolvidos no EO serão avaliados tanto por biomarcadores de dano proteico oxidativo (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) quanto por peroxidação lipídica (Isoprostanos, IsoPs). Uma avaliação adicional do perfil de estresse oxidativo será realizada medindo moléculas antioxidantes não enzimáticas (vitamina E; glutationa, GSH e ácido ascórbico, AA) e moléculas antioxidantes enzimáticas (superóxido dismutase, SOD, catalase, CAT, e glutationa peroxidase, GPx ). Para tanto, serão empregadas cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas com interface de cromatografia gasosa (GC-MS): HPLC para detectar vitamina E, glutationa, GSH e AA.

A etapa final será identificar prospectivamente um novo perfil de recém-nascidos de alto risco para disfunção pulmonar grave nos primeiros 12 meses de vida, com maior risco de desenvolver asma e DPOC em idades mais avançadas. Um resultado de longo prazo de todos os bebês inscritos será realizado para desvendar as relações entre análise da placenta, expressão de miRNA, inflamação e microbiota - como parte do expossoma in utero (corioamnionite ou restrição de crescimento fetal) e estresse oxidativo com inflamação - como parte do pós-natal fatores (suporte respiratório invasivo, persistência do canal arterial, pneumonia, sepse) - com desfecho pulmonar em termos de função pulmonar anormal aos 6 e 12 meses de idade.

Aos 6 e 12 meses de idade, os bebês receberão avaliação clínica e pulmonar. O teste de função pulmonar (TFP) será realizado em todos os bebês inscritos e incluirá análise de respiração corrente e teste de eliminação de nitrogênio. Os bebês serão colocados em posição supina, durante um sono tranquilo e natural, de acordo com as recomendações da American Thoracic Society/European Respiratory Society com medição de volumes pulmonares, fluxo, capacidade residual funcional, índice de depuração pulmonar 5% (LCI 5), depuração pulmonar Índice 2,5% (LCI 2,5), relação tempo até o pico do fluxo expiratório corrente/tempo expiratório (tPTEF/tE). A ultrassonografia pulmonar será realizada para descartar anormalidades pulmonares. Depois de permitir a adaptação à máscara, a respiração corrente e os loops de volume de fluxo por> 2 minutos ou> 20 respirações livres de artefatos serão registrados. Serão feitos TFP para relacionar os dados respiratórios funcionais com os do perfil bioquímico gerado. Quaisquer possíveis relações entre função pulmonar, marcadores bioquímicos imediatamente antes do nascimento e em bebês de 6 a 12 meses de idade e medidas antropométricas serão estudadas. O desenvolvimento e a função pulmonar durante a vida extrauterina estarão relacionados com as medidas pré-natais. Dados de bebês apropriados para a idade gestacional (AIG), bebês pequenos para a idade gestacional (PIG) ​​e bebês grandes para a idade gestacional (GIG) serão comparados.

Métodos de coleta de dados Vários tipos de dados serão coletados, incluindo quantitativos, qualitativos, gerados a partir de imagens, amostras de tecido e sangue. Os dados clínicos para os objetivos 1, 2 e 3 serão coletados e gerenciados usando ferramentas eletrônicas de captura de dados REDCap hospedadas em UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Será desenvolvido um formulário eletrônico dedicado para relato de caso (eCRF). Dados pseudo-anonimizados serão coletados nas unidades envolvidas. O investigador será responsável por garantir que a eCRF seja preenchida de forma adequada e completa. As fontes de informações clínicas incluem o prontuário médico do paciente, anotações hospitalares, registros laboratoriais originais, registros farmacêuticos, resultados de exames de ultrassom, etc.

Plano estatístico O objetivo primário do estudo é identificar se parâmetros clínicos, demográficos, laboratoriais e outros são capazes de prever o desenvolvimento de doença pulmonar crônica às 36 semanas de PMA e/ou de função pulmonar anormal aos 12 meses de idade. Assumindo um nível de precisão aceitável, com uma área sob a curva ROC de pelo menos 0,75 ± 0,15, é necessário um tamanho de amostra de 42 pacientes.

Análise estatística A amostra será descrita em suas características clínicas e demográficas por meio de índices estatísticos descritivos apropriados. Em profundidade, os dados qualitativos serão expressos como frequência percentual absoluta e relativa, enquanto as variáveis ​​quantitativas como média e desvio padrão (DP) ou mediana e intervalo interquartil (IQR), dependendo do caso. Para verificar a distribuição gaussiana das variáveis ​​quantitativas será aplicado o teste Shapiro-Wilk. As diferenças entre os grupos no início do estudo serão avaliadas, no que diz respeito aos dados qualitativos, pelo teste Qui-Quadrado ou pelo teste exato de Fisher-Freeman-Haltons, conforme apropriado. Em vez disso, os dados quantitativos serão comparados usando o teste t de Student para amostras independentes ou o teste U não paramétrico de Mann Withney, dependendo da distribuição dos dados. Gráficos de violino serão usados ​​para representar graficamente diferenças significativas ou clinicamente relevantes. A avaliação da diferença em termos de desfecho primário em 12 meses será avaliada pela análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. Em particular, será aplicado o teste log-rank e serão traçadas curvas de incidência cumulativa apropriadas. A fim de avaliar potenciais preditores do desfecho primário em 12 meses, serão ajustados modelos de regressão de Cox uni e multivariáveis. Em profundidade, os potenciais preditores do resultado serão avaliados por meio de modelos de regressão de Cox de risco proporcional ordinário, e os Hazard Ratios (HR) e os intervalos de confiança (IC) de 95% serão consequentemente relatados. A proporcionalidade das funções de risco será avaliada por inspeção visual dos perigos e dos gráficos residuais de Schoenfeld. Em caso de proporcionalidade duvidosa, serão ajustados modelos de regressão ponderados de Cox. Os preditores a serem incluídos no modelo multivariável serão selecionados com base na análise univariável (p<0,05 ou sugestiva, ou seja, 0,05 p <0,10) e na opinião de especialistas, consistente com a regra de pelo menos 10 eventos por variável de resultado e recomendações do TRIPOD. O desempenho do modelo será avaliado por diversos índices, como Cindex, correlação Somers Dxy-rank, valor R2 de Nagelkerke, intercepto de calibração e slop. O índice C pode ser interpretado como uma AUC, ou seja, uma medida da precisão do modelo. A significância estatística é definida para valores de p<0,05. Valores sugestivos de p (0,05, p < 0,10) também serão relatados. As análises estatísticas serão realizadas usando STATA (StataCorp, EUA) e R (https://www.r-project.org/).