Forebyggelse af kronisk lungesygdom (CLD - Forebyggelsesundersøgelse)

Baggrund Kronisk lungesygdom (CLD) er en af ​​de mest almindelige komplikationer af perinatal lungeskade, som repræsenterer en systemisk tilstand med langvarige følgesygdomme, såsom vedvarende pulmonal dysfunktion, astma-lignende symptomer og BPCO. CLD genkender mange prænatale risikofaktorer, herunder moderrygning, chorioamnionitis og intrauterin vækstrestriktion (IUGR), foruden postnatale risikofaktorer såsom hyperoksi, parenteral ernæring, inflammation og mekanisk ventilation. Eksponering for inflammation in utero ændrer neonatal immunudvikling og disponerer fosterlungen for en dysreguleret langvarig respons på invasiv mekanisk ventilation og suprafysiologisk oxygen. Reaktioner på skadelige (og beskyttende) påvirkninger tidligt i livet moduleres af genetiske og epigenetiske mekanismer, der kan resultere i permanente strukturelle ændringer med betydelige konsekvenser i voksenlivet. IUGR-graviditeter er karakteriseret ved øget oxidativt stress, og IUGR-spædbørn har høj risiko for hjerte-kar-sygdomme, metabolisk syndrom, lungedysfunktion og kroniske nyre- og luftvejssygdomme i voksenalderen På trods af den konstante stigning i viden om de mekanismer, der fører til progression af lungeskade, så indtil videre er der ikke udviklet nogen effektiv styring, der ville føre til CLD-forebyggelse.

Mål

1. prospektivt identificere potentielle biomarkører, der er i stand til at forudsige det alvorlige forløb af lungefunktion i de første 12 måneder af livet og realisere en ny profil til tidligt at identificere nyfødte med høj risiko.
2. opdage genetisk variansårsagsmodel (af MiSeq Illumina-platformen), der korrelerer med alvorlig pulmonal dysfunktion og astmaudvikling.
3. opdage mikroRNA'er samt anti- og pro-inflammatoriske cytokinvariationer (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10), der korrelerer med sværhedsgraden af ​​pulmonal dysfunktion i de første 12 måneder af livet og risikoen for astmaudvikling.

Eksperimentelt design Dette er et multicenter longitudinelt studie, hvis primære mål er at identificere en ny højrisiko neonatal profil for udvikling af kronisk lungesygdom (CLD) med udgangspunkt i det perinatale liv. For at nå dette mål vil alle deltagerenheder udføre vaginal podning til de tilmeldte mødre, vil indsamle placenta- og navlestrengsblod ved fødslen og perifert blod, bronkoalveolær lavagevæske (BALF), meconium og afføringsprøver fra alle tilmeldte nyfødte spædbørn. Undersøgelsen vil begynde med evaluering af prænatale risikofaktorer.

Efter fødslen fikseres moderkagen i 10 % bufferet formalin. Efterfølgende vil makroskopiske og mikroskopiske analyser blive udført i henhold til konsensuserklæringen fra Amsterdam placentaworkshopgruppen. En vaginal podning vil blive indsamlet på tidspunktet for fødslen for alle de tilmeldte kvinder. Tre ml navlestrengsblod (arterie og/eller vene) vil blive udført til analyse af miRNA, genetisk varians og cytokiner. Kun hos intuberede spædbørn vil BALF-prøven blive opnået ved at indsprøjte 1 ml/kg 0,9% natriumchlorid i endotrachealrøret og suge væsken ind i en steril slimfælde. Den første BALF-prøve vil blive indsamlet inden for de første 24 timer af livet, hvorimod yderligere BALF-prøver vil blive indsamlet ved 7 og 28 dage af livet hos nyfødte, som stadig vil være intuberet. Første meconiumprøve efter fødslen og yderligere afføringsprøver vil blive indsamlet efter 7, 28 levedage, 6 og 12 måneder af livet. Vaginale podninger, placenta, BALF, meconium og fæcesprøver vil blive opbevaret ved -80°C indtil videre behandling. For hver prøve vil bakteriel DNA-ekstraktion blive udført på en strengt kontrolleret niveau-2 biologisk sikkerhedsarbejdsplads ved hjælp af DANAGENE MICROBIOME DNA-kits (Danagen-Bioted) i henhold til producentens instruktioner.

I navlestrengsserum ved fødslen (arterien) og efter 48 timers levetid vil 8-10 kandidatmiRNA'er, især miR-451, miR-29b og miR-16 blive undersøgt, da det er påvist, at de har en hæmmende effekt på angiogenese gennem vaskulær endothelial growth factor (VEGF) suppression og miR er forbundet med genetisk modtagelighed for CLD. Den genetiske variansårsagsmodel vil blive udført i alle indskrevne nyfødte efter 48 timers levetid (mindst 500 μL fuldblod) ved hjælp af en MiSeq Illumina-platform, der tillader anvendelse af Next Generation Sequencing-teknologier.

For at påvise anti- og pro-inflammatoriske cytokinvariationer, der korrelerer med sygdommens sværhedsgrad over tid, vil der blive taget prøver fra navlestrengsblod og perifert blod (2 ml i et EDTA-rør) fra de inkluderede spædbørn ved indlæggelsen (inden for 48 timer efter livet) , ved 7 og 28 dage af livet, ved 6 og 12 måneder. Både anti- (INF-y) og pro-inflammatoriske (IL-6 og NGF) cytokinniveauer vil blive undersøgt. Alle prøver vil blive opbevaret ved -80 °C indtil testning. Cytokiner vil blive målt med et kommercielt tilgængeligt ELISA-kit i henhold til producentens instruktioner.

Efterforskerne vil også forsøge at udforske sammenhængen mellem mor og moderkagedata med nyfødte analyser i løbet af de første dage af livet. Ved indlæggelse af nyfødte på neonatal intensivafdeling vil der blive lagt stor vægt på at konstatere graden og variationerne i hæmo-oxygenering samt tilstedeværelsen af ​​infektion, der er årsagen til Oxidativ Stress (OS) og OS-relaterede sygdomme. Følgende prøver vil blive indsamlet: 1 ml perifert blod (inden for 48 timers levetid). Yderligere perifere blodprøver vil blive indsamlet efter 7 og 28 dage af livet, ved 6 og 12 måneder af livet.

Oxidativt stress (OS) og lipidmediatorer involveret i OS vil blive evalueret både af biomarkører for oxidativ proteinskade (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) og lipidperoxidation (Isoprostanes, IsoPs). En yderligere evaluering af oxidativ stressprofil vil blive udført ved at måle ikke-enzymatiske antioxidantmolekyler (vitamin E; glutathion, GSH og ascorbinsyre, AA) og enzymatiske antioxidantmolekyler (superoxiddismutase, SOD, katalase, CAT og glutathionperoxidase, GPx ). Til dette formål vil højtydende væskekromatografi (HPLC) og gaskromatografi-grænseflademassespektrometri (GC-MS) blive anvendt: HPLC til at påvise vitamin E, glutathion, GSH og AA.

Det sidste trin vil være prospektivt at identificere en ny profil af nyfødte med høj risiko for alvorlig pulmonal dysfunktion i de første 12 måneder af livet, med højere risiko for at udvikle astma og KOL i senere alder. Et langsigtet resultat af alle tilmeldte babyer vil blive udført for at opklare sammenhængen mellem placentaanalyse, miRNA-ekspression, inflammation og mikrobiota - som en del af in utero-eksposomet (chorioamnionitis eller fostervækstbegrænsning) og oxidativt stress med inflammation - som en del af postnatal faktorer (invasiv åndedrætsstøtte, Patent Ductus Arteriosus, lungebetændelse, sepsis) - med det pulmonale udfald i form af unormal lungefunktion ved 6 og 12 måneders alderen.

Ved 6 og 12 måneders alderen vil spædbørnene modtage klinisk og pulmonal evaluering. Lungefunktionstest (PFT) vil blive udført hos alle tilmeldte spædbørn og vil omfatte Tidal vejrtrækningsanalyse og Nitrogen Washout-test. Spædbørnene vil blive placeret i liggende stilling under rolig, naturlig søvn i henhold til anbefalingerne fra American Thoracic Society/European Respiratory Society med måling af lungevolumener, flow, funktionel restkapacitet, Lung Clearence Index 5% (LCI 5), Lung Clearence Indeks 2,5 % (LCI 2,5), tid til peak tidal ekspiratorisk flow/ekspiratorisk tid-forhold (tPTEF/tE). Lungeultralyd vil blive udført for at udelukke lungeabnormiteter. Efter at have tilladt tilpasning til masken, vil tidevandsånding, flowvolumen-loops i >2 minutter eller >20 artefaktfrie vejrtrækninger blive registreret. PFT vil blive lavet for at relatere de funktionelle respiratoriske data med dem af genereret biokemisk profil. Eventuelle sammenhænge mellem lungefunktion, biokemiske markører lige før fødslen og hos spædbørn i 6-12 måneders alderen og antropometriske målinger vil blive undersøgt. Lungeudvikling og -funktion under ekstrauterint liv vil være relateret til prænatale målinger. Data, der er passende for spædbørn i gestationsalder (AGA), små for spædbørn i gestationsalder (SGA) og store for spædbørn i gestationsalder (LGA) vil blive sammenlignet.

Metoder til dataindsamling Der vil blive indsamlet flere typer data, herunder kvantitative, kvalitative, genereret fra billed-, vævs- og blodprøver. Kliniske data for mål 1, 2 og 3 vil blive indsamlet og administreret ved hjælp af REDCap elektroniske datafangstværktøjer hostet hos UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

En dedikeret elektronisk sagsrapportformular (eCRF) vil blive udviklet. Pseudo-anonimiserede data vil blive indsamlet fra de involverede enheder. Efterforskeren vil være ansvarlig for at sikre, at eCRF er korrekt og fuldstændigt udfyldt. Kilder til klinisk information omfatter lægens patientjournal, hospitalsnotater, originale laboratoriejournaler, apoteksjournaler, resultater af ultralydsundersøgelse osv.

Statistisk plan Det primære endepunkt for undersøgelsen er at identificere, om kliniske, demografiske, laboratorie- og andre parametre er i stand til at forudsige udviklingen af ​​kronisk lungesygdom ved 36 ugers PMA og/eller abnorm lungefunktion ved 12 måneders alderen. Forudsat et acceptabelt nøjagtighedsniveau med et område under ROC-kurven på mindst 0,75 ± 0,15, er en prøvestørrelse på 42 patienter påkrævet.

Statistisk analyse Prøven vil blive beskrevet i dens kliniske og demografiske karakteristika ved hjælp af passende beskrivende statistiske indekser. I dybden vil kvalitative data blive udtrykt som absolut og relativ procentvis frekvens, mens kvantitative variabler som enten middelværdi og standardafvigelse (SD) eller median og interkvartilområde (IQR), afhængigt af tilfældet. For at verificere den Gaussiske fordeling af kvantitative variable vil Shapiro-Wilk-testen blive anvendt. Forskelle mellem grupper ved baseline vil blive evalueret med hensyn til kvalitative data ved enten Chi-Squared-testen eller Fisher-Freeman-Haltons eksakte test, alt efter hvad der er relevant. Kvantitative data vil i stedet blive sammenlignet ved hjælp af Students t-test for uafhængige prøver eller Mann Withneys ikke-parametriske U-test, afhængigt af datafordelingen. Violinplot vil blive brugt til grafisk at repræsentere signifikante eller klinisk relevante forskelle. Evalueringen af ​​forskellen med hensyn til primært resultat efter 12 måneder vil blive evalueret ved Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Især vil log-rank test blive anvendt, og passende kumulative incidenskurver vil blive tegnet. For at vurdere potentielle prædiktorer for det primære resultat efter 12 måneder, vil uni- og multivariable Cox-regressionsmodeller blive tilpasset. I dybden vil de potentielle prædiktorer for udfaldet blive evalueret ved hjælp af almindelige proportional hazard Cox regressionsmodeller, og Hazard Ratios (HR) og 95% konfidensintervallerne (CI'er) vil følgelig blive rapporteret. Proportionaliteten af ​​farefunktionerne vil blive vurderet ved visuel inspektion af farerne og Schoenfeld-restplot. I tilfælde af tvivlsom proportionalitet vil Cox-vægtede regressionsmodeller blive monteret. Prædiktorer, der skal inkluderes i den multivariable model, vil blive udvalgt baseret på den univariable analyse (p<0,05 eller suggestiv, dvs. 0,05 p <0,10) og ekspertudtalelse, i overensstemmelse med reglen om mindst 10 hændelser efter udfaldsvariabel, og TRIPOD-anbefalinger. Modellens ydeevne vil blive evalueret af flere indekser, såsom Cindex, Somers Dxy-rank korrelation, Nagelkerkes R2 værdi, kalibreringsintercept og slop. C-indekset kan fortolkes som en AUC, det vil sige et mål for modellens nøjagtighed. Statistisk signifikans er sat for værdier på p<0,05. Suggestive p-værdier (0,05, p < 0,10) vil også blive rapporteret. Statistiske analyser vil blive udført ved hjælp af STATA (StataCorp, USA) og R (https://www.r-project.org/).