Zapobieganie przewlekłej chorobie płuc (CLD – badanie dotyczące zapobiegania)

Tło Przewlekła choroba płuc (CLD) jest jednym z najczęstszych powikłań okołoporodowego uszkodzenia płuc, które stanowi stan ogólnoustrojowy z długotrwałymi następstwami, takimi jak uporczywa dysfunkcja płuc, objawy podobne do astmy i BPCO. CLD rozpoznaje wiele prenatalnych czynników ryzyka, w tym palenie przez matkę, zapalenie błon płodowych i wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu (IUGR), oprócz poporodowych czynników ryzyka, takich jak hiperoksja, żywienie pozajelitowe, zapalenie i wentylacja mechaniczna. Narażenie na zapalenie macicy zmienia rozwój odporności noworodków i predysponuje płuca płodu do rozregulowanej, długotrwałej odpowiedzi na inwazyjną wentylację mechaniczną i tlen ponadfizjologiczny. Reakcje na szkodliwe (i ochronne) wpływy na wczesnym etapie życia są modulowane przez mechanizmy genetyczne i epigenetyczne, które mogą skutkować trwałymi zmianami strukturalnymi ze znaczącymi konsekwencjami w wieku dorosłym. Ciąża IUGR charakteryzuje się zwiększonym stresem oksydacyjnym, a u noworodków z IUGR występuje duże ryzyko chorób układu krążenia, zespołu metabolicznego, dysfunkcji płuc oraz przewlekłych chorób nerek i układu oddechowego w wieku dorosłym. jak dotąd nie opracowano skutecznego postępowania, które prowadziłoby do zapobiegania CLD.

Cele

1. prospektywnie zidentyfikować potencjalne biomarkery umożliwiające przewidzenie ciężkiego przebiegu czynności płuc w pierwszych 12 miesiącach życia i opracować nowy profil umożliwiający wczesną identyfikację noworodków wysokiego ryzyka.
2. wykryć model przyczynowości wariancji genetycznej (za pomocą platformy MiSeq Illumina) korelujący z ciężką dysfunkcją płuc i rozwojem astmy.
3. wykrywa mikroRNA oraz zmiany w cytokinach przeciwzapalnych i prozapalnych (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) korelujące z nasileniem dysfunkcji płuc w ciągu pierwszych 12 miesięcy życia i ryzyko rozwoju astmy.

Projekt eksperymentu Jest to wieloośrodkowe badanie podłużne, którego głównym celem jest identyfikacja nowego profilu noworodków wysokiego ryzyka rozwoju przewlekłej choroby płuc (CLD), począwszy od okresu okołoporodowego. Aby osiągnąć ten cel, wszystkie uczestniczące jednostki wykonają wymaz z pochwy zarejestrowanych matek, pobiorą łożysko i krew pępowinową po urodzeniu oraz krew obwodową, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), smółkę i kał wszystkich zarejestrowanych noworodków. Badanie rozpocznie się od oceny prenatalnych czynników ryzyka.

Po porodzie łożyska zostaną utrwalone w 10% buforowanej formalinie. Następnie zostaną przeprowadzone analizy makroskopowe i mikroskopowe zgodnie z konsensusem grupy warsztatów łożyskowych w Amsterdamie. Od wszystkich zapisanych kobiet w momencie porodu zostanie pobrany wymaz z pochwy. Zostaną wykonane trzy ml krwi pępowinowej (tętniczej i/lub żylnej) w celu analizy miRNA, wariancji genetycznej i cytokin. Tylko w przypadku zaintubowanych niemowląt próbkę BALF można uzyskać poprzez wkroplenie 1 ml/kg 0,9% chlorku sodu do rurki dotchawiczej i zassanie płynu do sterylnej pułapki śluzowej. Pierwsza próbka BALF zostanie pobrana w ciągu pierwszych 24 godzin życia, natomiast kolejne próbki BALF zostaną pobrane w 7 i 28 dniu życia u noworodków, które będą jeszcze zaintubowane. Pierwsza próbka smółki po urodzeniu oraz dodatkowe próbki kału zostaną pobrane w 7, 28 dniu życia, 6 i 12 miesiącu życia. Wymazy z pochwy, łożysko, BALF, smółka i próbki kału będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu dalszego przetwarzania. Z każdej próbki zostanie przeprowadzona ekstrakcja bakteryjnego DNA w ściśle kontrolowanym miejscu pracy, zapewniającym bezpieczeństwo biologiczne na poziomie 2, przy użyciu zestawów DANAGENE MICROBIOME DNA (Danagen-Bioted) zgodnie z instrukcjami producenta.

W surowicy pępowiny po urodzeniu (tętnicy) i po 48 godzinach życia zbadanych zostanie 8–10 potencjalnych miRNA, w szczególności miR-451, miR-29b i miR-16, ponieważ wykazano, że mają one działanie hamujące na Angiogeneza poprzez supresję czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i miR jest powiązana z genetyczną podatnością na CLD. Model przyczynowości wariancji genetycznej zostanie przeprowadzony u wszystkich zapisanych noworodków w 48. godzinie życia (co najmniej 500 µl krwi pełnej) przy użyciu platformy MiSeq Illumina umożliwiającej zastosowanie technologii sekwencjonowania nowej generacji.

W celu wykrycia zmian w poziomie cytokin przeciwzapalnych i prozapalnych korelujących z ciężkością choroby w czasie, przy przyjęciu (w ciągu 48 godzin życia) od objętych badaniem niemowląt zostanie pobrana próbka krwi pępowinowej i krwi obwodowej (2 ml do probówki EDTA). , w 7 i 28 dniu życia, w 6 i 12 miesiącu. Badany będzie poziom cytokin zarówno anty- (INF-y), jak i prozapalnych (IL-6 i NGF). Wszystkie próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia badania. Cytokiny będą mierzone za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

Badacze spróbują także zbadać powiązanie danych matki i łożyska z analizą noworodków w pierwszych dniach życia. Przy przyjęciu noworodka na Oddział Intensywnej Terapii Noworodka szczególną uwagę należy zwrócić na ustalenie stopnia i zmienności hemooksygenacji, a także na obecność infekcji będącej przyczyną stresu oksydacyjnego (OS) i chorób z nim związanych. Pobrane zostaną następujące próbki: 1 ml krwi obwodowej (w ciągu 48 godzin życia). Dodatkowe próbki krwi obwodowej zostaną pobrane w 7. i 28. dniu życia oraz w 6. i 12. miesiącu życia.

Stres oksydacyjny (OS) i mediatory lipidowe zaangażowane w OS zostaną ocenione zarówno za pomocą biomarkerów oksydacyjnego uszkodzenia białek (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP), jak i peroksydacji lipidów (Isoprostanes, IsoP). Dalsza ocena profilu stresu oksydacyjnego zostanie przeprowadzona poprzez pomiar nieenzymatycznych cząsteczek przeciwutleniających (witamina E; glutation, GSH i kwas askorbinowy, AA) i enzymatycznych cząsteczek przeciwutleniających (dysmutaza ponadtlenkowa, SOD, katalaza, CAT i peroksydaza glutationowa, GPx ). W tym celu wykorzystana zostanie wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) i spektrometria mas z interfejsem chromatografii gazowej (GC-MS): HPLC do wykrywania witaminy E, glutationu, GSH i AA.

Ostatnim krokiem będzie prospektywna identyfikacja nowego profilu noworodków wysokiego ryzyka wystąpienia ciężkiej dysfunkcji płuc w pierwszych 12 miesiącach życia, obciążonych większym ryzykiem rozwoju astmy i POChP w późniejszym wieku. Przeprowadzone zostaną długoterminowe wyniki wszystkich zapisanych dzieci, aby odkryć powiązania między analizą łożyska, ekspresją miRNA, stanem zapalnym i mikroflorą – w ramach ekspozycji w macicy (zapalenie błon płodowych lub ograniczenie wzrostu płodu) oraz stresem oksydacyjnym ze stanem zapalnym – w ramach rozwoju poporodowego. czynników (inwazyjne wspomaganie oddychania, przetrwały przewód tętniczy, zapalenie płuc, posocznica) – z następstwem pulmonologicznym pod względem nieprawidłowej funkcji płuc w 6. i 12. miesiącu życia.

W wieku 6 i 12 miesięcy niemowlęta zostaną poddane ocenie klinicznej i płucnej. U wszystkich zapisanych niemowląt zostanie wykonane badanie czynności płuc (PFT), które będzie obejmować analizę oddechu oddechowego i test wymywania azotu. Niemowlęta zostaną ułożone w pozycji leżącej, podczas spokojnego, naturalnego snu, zgodnie z zaleceniami American Thoracic Society/European Respiratory Society, z pomiarem objętości płuc, przepływu, czynnościowej pojemności resztkowej, wskaźnika klirensu płuc 5% (LCI 5), klirensu płuc Indeks 2,5% (LCI 2,5), stosunek czasu do szczytowego przepływu oddechowo-wydechowego/czasu wydechowego (tPTEF/tE). Zostanie wykonane USG płuc, aby wykluczyć nieprawidłowości w płucach. Po umożliwieniu dostosowania do maski rejestrowane będą oddechy oddechowe, pętle objętości przepływu przez >2 minuty lub >20 oddechów wolnych od artefaktów. PFT zostanie wykonane w celu powiązania danych czynnościowych dotyczących układu oddechowego z wynikami wygenerowanego profilu biochemicznego. Zbadane zostaną wszelkie możliwe powiązania pomiędzy czynnością płuc, markerami biochemicznymi tuż przed urodzeniem i u niemowląt w wieku 6-12 miesięcy a pomiarami antropometrycznymi. Rozwój i czynność płuc w życiu pozamacicznym zostaną powiązane z pomiarami prenatalnymi. Porównane zostaną dane dotyczące niemowląt odpowiednich dla wieku ciążowego (AGA), niemowląt małych w stosunku do wieku ciążowego (SGA) i niemowląt dużych w stosunku do wieku ciążowego (LGA).

Metody gromadzenia danych Gromadzonych będzie kilka rodzajów danych, w tym dane ilościowe, jakościowe, generowane na podstawie obrazowania, próbek tkanek i krwi. Dane kliniczne dla celów 1, 2 i 3 będą gromadzone i zarządzane przy użyciu narzędzi do elektronicznego przechwytywania danych REDCap hostowanych w UO1-Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Opracowany zostanie specjalny elektroniczny formularz sprawozdania ze sprawy (eCRF). Z zaangażowanych jednostek będą zbierane dane pseudoanonimowe. Badacz będzie odpowiedzialny za prawidłowe i kompletne wypełnienie eCRF. Źródłami informacji klinicznej są: karta pacjenta lekarza, notatki szpitalne, oryginalna dokumentacja laboratoryjna, dokumentacja apteczna, wyniki badania USG itp.

Plan statystyczny Pierwszorzędowym punktem końcowym badania jest określenie, czy parametry kliniczne, demograficzne, laboratoryjne i inne pozwalają przewidzieć rozwój przewlekłej choroby płuc w 36 tygodniu PMA i/lub nieprawidłowej czynności płuc w 12 miesiącu życia. Zakładając akceptowalny poziom dokładności, z obszarem pod krzywą ROC wynoszącym co najmniej 0,75 ± 0,15, wymagana jest wielkość próby wynosząca 42 pacjentów.

Analiza statystyczna Próba zostanie opisana pod względem charakterystyki klinicznej i demograficznej za pomocą odpowiednich wskaźników statystyki opisowej. W zależności od przypadku dane jakościowe zostaną wyrażone jako bezwzględna i względna częstotliwość procentowa, natomiast zmienne ilościowe jako średnia i odchylenie standardowe (SD) lub mediana i rozstęp międzykwartylowy (IQR). Do weryfikacji rozkładu Gaussa zmiennych ilościowych zastosowany zostanie test Shapiro-Wilka. Różnice między grupami na początku badania zostaną ocenione, w odniesieniu do danych jakościowych, odpowiednio za pomocą testu Chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera-Freemana-Haltona. Zamiast tego dane ilościowe zostaną porównane przy użyciu testu t-Studenta dla niezależnych próbek lub nieparametrycznego testu U Manna Withneya, w zależności od rozkładu danych. Wykresy skrzypiec zostaną wykorzystane do graficznego przedstawienia znaczących lub istotnych klinicznie różnic. Ocena różnicy w zakresie pierwotnego wyniku po 12 miesiącach zostanie dokonana za pomocą analizy przeżycia Kaplana-Meiera. W szczególności zastosowany zostanie test log-rank i wykreślone zostaną odpowiednie krzywe skumulowanej częstości występowania. Aby ocenić potencjalne czynniki predykcyjne pierwotnego wyniku po 12 miesiącach, dopasowane zostaną jedno- i wielowymiarowe modele regresji Coxa. Dogłębnie, potencjalne predyktory wyniku zostaną ocenione za pomocą modeli regresji Coxa o zwykłym proporcjonalnym hazardzie, a następnie zostaną zgłoszone współczynniki ryzyka (HR) i 95% przedziały ufności (CI). Proporcjonalność funkcji hazardu zostanie oceniona poprzez wizualną kontrolę zagrożeń i wykresów reszt Schoenfelda. W przypadku wątpliwej proporcjonalności zostaną dopasowane modele regresji ważonej Coxa. Predyktory, które zostaną uwzględnione w modelu wielozmiennym, zostaną wybrane na podstawie analizy jednozmiennej (p<0,05 lub sugestywnej, tj. 0,05 p <0,10) oraz opinii eksperckiej, zgodnej z zasadą co najmniej 10 zdarzeń według zmiennej wynikowej oraz zaleceniami TRIPOD. Wydajność modelu będzie oceniana za pomocą kilku wskaźników, takich jak Cindex, korelacja rang Somersa Dxy, wartość R2 Nagelkerkego, punkt przecięcia i nachylenie kalibracji. Indeks C można interpretować jako AUC, czyli miarę dokładności modelu. Istotność statystyczną ustala się dla wartości p<0,05. Sugestywne wartości p (0,05, p < 0,10) również zostaną podane. Analizy statystyczne zostaną przeprowadzone przy użyciu STATA (StataCorp, USA) i R (https://www.r-project.org/).