Kroonisen keuhkosairauden ehkäisy (CLD - Prevention Study)

Taustaa Krooninen keuhkosairaus (CLD) on yksi perinataalisen keuhkovaurion yleisimmistä komplikaatioista, joka edustaa systeemistä tilaa, jolla on pitkäaikaisia ​​seurauksia, kuten jatkuva keuhkojen toimintahäiriö, astman kaltaiset oireet ja BPCO. CLD tunnistaa monia synnytystä edeltäviä riskitekijöitä, kuten äidin tupakoinnin, suonikalvontulehduksen ja kohdunsisäisen kasvun rajoituksen (IUGR), synnytyksen jälkeisten riskitekijöiden, kuten hyperoksia, parenteraalinen ravitsemus, tulehdus ja mekaaninen ventilaatio, lisäksi. Kohdun tulehdukselle altistuminen muuttaa vastasyntyneen immuunijärjestelmän kehittymistä ja altistaa sikiön keuhkojen säätelemättömälle pitkäkestoiselle vasteelle invasiiviselle mekaaniselle ventilaatiolle ja suprafysiologiselle hapelle. Reaktiot vahingollisiin (ja suojaaviin) vaikutuksiin varhaisessa iässä moduloidaan geneettisten ja epigeneettisten mekanismien avulla, mikä voi johtaa pysyviin rakenteellisiin muutoksiin, joilla on merkittäviä seurauksia aikuisiässä. IUGR-raskauksille on ominaista lisääntynyt oksidatiivinen stressi, ja IUGR-vauvoilla on suuri riski sairastua sydän- ja verisuonitauteihin, metaboliseen oireyhtymään, keuhkojen vajaatoimintaan ja kroonisiin munuais- ja hengityselinsairauksiin aikuisiässä. Toistaiseksi ei ole kehitetty tehokasta hoitoa, joka johtaisi CLD:n ehkäisyyn.

Tavoitteet

1. tunnistaa prospektiivisesti mahdolliset biomarkkerit, jotka pystyvät ennustamaan keuhkojen toiminnan vakavan etenemisen 12 ensimmäisen elinkuukauden aikana, ja toteuttamaan uusi profiili riskialttiiden vastasyntyneiden tunnistamiseksi varhaisessa vaiheessa.
2. havaita geneettisen varianssin syy-malli (MiSeq Illumina -alustalla), joka korreloi vakavan keuhkohäiriön ja astman kehittymisen kanssa.
3. tunnistaa mikroRNA:t sekä anti- ja pro-inflammatoriset sytokiinimuunnelmat (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10), jotka korreloivat keuhkojen toimintahäiriön vaikeusasteen kanssa ensimmäisen 12 kuukauden aikana elämästä ja astman kehittymisen riskistä.

Kokeellinen suunnittelu Tämä on monikeskuslainen pitkittäistutkimus, jonka ensisijaisena tavoitteena on tunnistaa uusi korkean riskin vastasyntyneen profiili kroonisen keuhkosairauden (CLD) kehittymiselle perinataalisesta elämästä alkaen. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi kaikki osallistuvat yksiköt ottavat emättimestä vanupuikolla ilmoittautuneille äideille, keräävät istukan ja napanuoraveren syntymän yhteydessä sekä perifeerisen veren, bronkoalveolaarisen huuhtelunesteen (BALF), mekonium- ja ulostenäytteet kaikilta ilmoittautuneilta vastasyntyneiltä. Tutkimus alkaa synnytystä edeltävien riskitekijöiden arvioinnilla.

Synnytyksen jälkeen istukat kiinnitetään 10 % puskuroituun formaliiniin. Myöhemmin makroskooppiset ja mikroskooppiset analyysit suoritetaan Amsterdamin istukkatyöpajaryhmän konsensuslausunnon mukaisesti. Kaikilta ilmoittautuneilta naisilta otetaan emättimen vanupuikko synnytyksen yhteydessä. Kolme ml napanuoraverta (valtimo ja/tai laskimo) suoritetaan miRNA:n, geneettisen varianssin ja sytokiinien analysoimiseksi. Vain intuboiduilla pikkulapsilla BALF-näyte otetaan tiputtamalla 1 ml/kg 0,9-prosenttista natriumkloridia endotrakeaaliputkeen ja imemällä neste steriiliin limaloukuun. Ensimmäinen BALF-näyte kerätään ensimmäisen 24 tunnin aikana, kun taas lisää BALF-näytteitä otetaan 7. ja 28. elinpäivänä vastasyntyneistä, jotka ovat edelleen intuboitavissa. Ensimmäinen mekoniumnäyte syntymän jälkeen ja ylimääräiset ulostenäytteet otetaan 7, 28 päivän, 6 ja 12 kuukauden iässä. Emätinnäytteitä, istukka-, BALF-, mekonium- ja ulostenäytteet säilytetään -80°C:ssa jatkokäsittelyyn asti. Jokaiselle näytteelle suoritetaan bakteeri-DNA-uutto tiukasti valvotussa tason 2 biologisessa turvallisuustyöpaikassa käyttämällä DANAGENE MICROBIOME DNA -sarjoja (Danagen-Bioted) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Napanuoran seerumissa syntymähetkellä (valtimolla) ja 48 tunnin jälkeen tutkitaan 8-10 ehdokasmiRNA:ta, erityisesti miR-451, miR-29b ja miR-16, koska on osoitettu, että niillä on estävä vaikutus angiogeneesi verisuonten endoteelikasvutekijän (VEGF) suppression ja miR:n kautta liittyy geneettiseen herkkyyteen CLD:lle. Geneettisen varianssin syy-malli suoritetaan kaikille vastasyntyneille 48 tunnin iässä (vähintään 500 µl kokoverta) käyttäen MiSeq Illumina -alustaa, joka mahdollistaa seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoiden soveltamisen.

Anti- ja tulehdusta edistävien sytokiinivaihteluiden havaitsemiseksi, jotka korreloivat sairauden vakavuuden kanssa ajan mittaan, napanuoraverestä ja perifeerisestä verinäytteestä (2 ml EDTA-putkeen) otetaan mukana olevilta imeväisiltä vastaanoton yhteydessä (48 tunnin sisällä elämästä). , 7 ja 28 päivän iässä, 6 ja 12 kuukauden iässä. Sekä anti- (INF-y) että proinflammatoriset (IL-6 ja NGF) sytokiinitasot tutkitaan. Kaikki näytteet säilytetään -80 °C:ssa testaukseen asti. Sytokiinit mitataan kaupallisesti saatavalla ELISA-sarjalla valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Tutkijat yrittävät myös selvittää äidin ja istukan välistä yhteyttä vastasyntyneiden analyysien avulla ensimmäisten elinpäivien aikana. Vastasyntyneen vastasyntyneiden teho-osastolle tullessa kiinnitetään paljon huomiota hemo-hapetuksen asteen ja vaihteluiden sekä oksidatiivisen stressin (OS) ja OS:hen liittyvien sairauksien alkulähteenä olevan infektion selvittämiseen. Seuraavat näytteet otetaan: 1 ml ääreisverta (48 tunnin sisällä elämästä). Lisää perifeerisiä verinäytteitä otetaan 7 ja 28 elinpäivänä sekä 6 ja 12 kuukauden iässä.

Oksidatiivista stressiä (OS) ja OS:ssä mukana olevia lipidivälittäjiä arvioidaan sekä oksidatiivisten proteiinivaurioiden (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) että lipidiperoksidaatioiden (Isoprostanes, IsoPs) biomarkkerien avulla. Oksidatiivisen stressin profiilin lisäarviointi suoritetaan mittaamalla ei-entsymaattisia antioksidanttimolekyylejä (E-vitamiini; glutationi, GSH ja askorbiinihappo, AA) ja entsymaattisia antioksidanttimolekyylejä (superoksididismutaasi, SOD, katalaasi, CAT ja glutationiperoksidaasi, GPx) ). Tätä tarkoitusta varten käytetään korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) ja kaasukromatografiaan liitettyä massaspektrometriaa (GC-MS): HPLC:tä E-vitamiinin, glutationin, GSH:n ja AA:n havaitsemiseen.

Viimeinen vaihe on prospektiivisen uuden profiilin tunnistaminen riskialttiista vastasyntyneistä, joilla on vakava keuhkohäiriö ensimmäisen 12 kuukauden aikana ja joilla on suurempi riski sairastua astmaan ja keuhkoahtaumatautiin myöhemmällä iällä. Kaikille ilmoittautuneille vauvoille tehdään pitkän aikavälin tulos, jotta voidaan selvittää istukan analyysin, miRNA:n ilmentymisen, tulehduksen ja mikrobiotan väliset suhteet - osana in utero altistusta (koroamnioniitti tai sikiön kasvun rajoitus) ja oksidatiivisen stressin ja tulehduksen välillä - osana postnataalia. tekijät (invasiivinen hengitystuki, Patent Ductus Arteriosus, keuhkokuume, sepsis) - keuhkojen lopputuloksena keuhkojen epänormaalin toiminnan suhteen 6 ja 12 kuukauden iässä.

6 ja 12 kuukauden iässä vauvoille tehdään kliininen ja keuhkoarviointi. Keuhkojen toimintatesti (PFT) suoritetaan kaikille mukana oleville imeväisille, ja se sisältää tidal-hengitysanalyysin ja typen poistotestin. Vauvat asetetaan makuuasentoon, hiljaisen, luonnollisen unen aikana American Thoracic Society/European Respiratory Society -suositusten mukaisesti, mukaan lukien keuhkojen tilavuus, virtaus, toiminnallinen jäännöskapasiteetti, keuhkojen puhdistumaindeksi 5 % (LCI 5), keuhkojen puhdistuma. Indeksi 2,5 % (LCI 2,5), aika huipun saavuttamiseen uloshengitysvirtauksen/uloshengitysajan suhde (tPTEF/tE). Keuhkojen ultraääni tehdään keuhkojen poikkeavuuksien poissulkemiseksi. Kun maskiin sopeutuminen on annettu, vuorovesihengitys, virtaustilavuussilmukat > 2 minuutin ajan tai >20 artefaktitonta hengitystä tallennetaan. PFT tehdään toiminnallisten hengitystietojen yhdistämiseksi generoidun biokemiallisen profiilin tietoihin. Mahdollisia suhteita keuhkojen toiminnan, juuri ennen syntymää ja 6-12 kuukauden ikäisten imeväisten biokemiallisten merkkiaineiden sekä antropometristen mittausten välillä tutkitaan. Keuhkojen kehitys ja toiminta kohdunulkoisen elämän aikana liittyvät prenataalisiin mittauksiin. Tietoja verrataan gestaatioiän (AGA) vauvoille, pienille raskausiän (SGA) vauvoille ja suurille raskausiän (LGA) vauvoille.

Tiedonkeruumenetelmät Kerätään monenlaisia ​​tietoja, mukaan lukien kvantitatiiviset, kvalitatiiviset, kuvantamisesta, kudos- ja verinäytteistä saadut tiedot. Tavoitteiden 1, 2 ja 3 kliiniset tiedot kerätään ja hallitaan REDCap-elektronisten tiedonkeruutyökalujen avulla, jotka sijaitsevat osoitteessa UO1-Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Erillinen sähköinen tapausraporttilomake (eCRF) kehitetään. Mukana olevilta yksiköiltä kerätään pseudo-anonimoituja tietoja. Tutkija on vastuussa siitä, että eCRF on täytetty oikein ja täydellisesti. Kliinisen tiedon lähteitä ovat lääkärin potilaskertomus, sairaalan muistiinpanot, alkuperäiset laboratoriotiedot, apteekkitiedot, ultraäänitutkimuksen tulokset jne.

Tilastosuunnitelma Tutkimuksen ensisijaisena päätepisteenä on selvittää, pystyvätkö kliiniset, demografiset, laboratorio- ja muut parametrit ennustamaan kroonisen keuhkosairauden kehittymisen 36 viikon PMA:n kohdalla ja/tai epänormaalin keuhkosairauden kehittymistä 12 kuukauden iässä. Jos oletetaan hyväksyttävä tarkkuustaso ja alue ROC-käyrän alla on vähintään 0,75 ± 0,15, näytteen koko on 42 potilasta.

Tilastollinen analyysi Otos kuvataan sen kliinisillä ja demografisilla ominaisuuksilla käyttäen asianmukaisia ​​kuvaavia tilastoindeksejä. Laadulliset tiedot ilmaistaan ​​syvemmin absoluuttisena ja suhteellisena prosentuaalisena frekvenssinä, kun taas kvantitatiiviset muuttujat joko keskiarvona ja keskihajontana (SD) tai mediaani- ja kvartiilivälinä (IQR) tapauksesta riippuen. Kvantitatiivisten muuttujien Gaussin jakauman tarkistamiseksi käytetään Shapiro-Wilk-testiä. Erot ryhmien välillä lähtötilanteessa arvioidaan kvalitatiivisten tietojen osalta joko Chi-Squared-testillä tai Fisher-Freeman-Haltonsin eksaktitestillä, tapauksen mukaan. Kvantitatiivisia tietoja verrataan sen sijaan käyttämällä Studentin t-testiä riippumattomille näytteille tai Mann Withneyn ei-parametrista U-testiä tietojen jakautumisesta riippuen. Viulun juonteita käytetään esittämään graafisesti merkittäviä tai kliinisesti merkityksellisiä eroja. Ensisijaisen tuloksen eron arviointi 12 kuukauden kohdalla arvioidaan Kaplan-Meierin eloonjäämisanalyysillä. Erityisesti käytetään log-rank-testiä ja piirretään asianmukaiset kumulatiiviset esiintyvyyskäyrät. Ensisijaisen tuloksen mahdollisten ennustajien arvioimiseksi 12 kuukauden kohdalla sovitetaan yksi- ja monimuuttuja Cox-regressiomallit. Syvällisesti lopputuloksen potentiaaliset ennustajat arvioidaan tavallisten suhteellisten riskien Cox-regressiomallien avulla, minkä seurauksena riskisuhteet (HR) ja 95 %:n luottamusvälit (CI:t) raportoidaan. Vaarafunktioiden suhteellisuus arvioidaan vaarojen ja Schoenfeldin jäännöspalojen silmämääräisellä tarkastuksella. Jos suhteellisuus on epävarmaa, sovitetaan Cox-painotetut regressiomallit. Monimuuttujamalliin sisällytettävät ennustajat valitaan yksimuuttuja-analyysin (p<0,05 tai viitteellinen, eli 0,05 p <0,10) ja asiantuntijalausunnon, joka on vähintään 10 tapahtuman tulosmuuttujakohtaisen säännön ja TRIPOD-suositusten mukainen. Mallin suorituskykyä arvioidaan useilla indekseillä, kuten Cindex, Somers Dxy-rank -korrelaatio, Nagelkerken R2-arvo, kalibrointileikkauspiste ja jyrkkyys. C-indeksi voidaan tulkita AUC:ksi eli mallin tarkkuuden mittana. Tilastollinen merkitsevyys asetetaan arvoille p<0,05. Myös ehdottavat p-arvot (0,05, p < 0,10) raportoidaan. Tilastolliset analyysit tehdään käyttämällä STATAa (StataCorp, USA) ja R:tä (https://www.r-project.org/).