Prevence chronického onemocnění plic (CLD – Prevention Study)

Pozadí Chronické onemocnění plic (CLD) je jednou z nejčastějších komplikací perinatálního poškození plic, které představuje systémový stav s dlouhodobými následky, jako je přetrvávající plicní dysfunkce, symptomy podobné astmatu a BPCO. CLD rozpoznává mnoho prenatálních rizikových faktorů, včetně kouření matek, chorioamnionitidy a intrauterinní růstové restrikce (IUGR), vedle postnatálních rizikových faktorů, jako je hyperoxie, parenterální výživa, zánět a mechanická ventilace. Expozice zánětu in utero mění neonatální imunitní vývoj a predisponuje plíce plodu k dysregulované prodloužené odpovědi na invazivní mechanickou ventilaci a suprafyziologický kyslík. Reakce na škodlivé (a ochranné) vlivy v raném věku jsou modulovány genetickými a epigenetickými mechanismy, které mohou vést k trvalým strukturálním změnám s významnými důsledky v dospělosti. Těhotenství IUGR se vyznačuje zvýšeným oxidačním stresem a kojenci IUGR jsou ve vysokém riziku kardiovaskulárních onemocnění, metabolického syndromu, plicní dysfunkce a chronických onemocnění ledvin a dýchacích cest v dospělosti I přes neustálé zvyšování znalostí o mechanismech vedoucích k progresi poškození plic, tzv. dosud nebyl vyvinut žádný účinný management, který by vedl k prevenci CLD.

Cíle

1. prospektivně identifikovat potenciální biomarkery schopné předpovědět závažný průběh plicních funkcí v prvních 12 měsících života a realizovat nový profil pro včasnou identifikaci vysoce rizikových novorozenců.
2. detekovat kauzální model genetické variace (platformou MiSeq Illumina) korelující s těžkou plicní dysfunkcí a rozvojem astmatu.
3. detekovat mikroRNA a také protizánětlivé a prozánětlivé cytokinové variace (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) korelující se závažností plicní dysfunkce v prvních 12 měsících života a rizika rozvoje astmatu.

Experimentální design Jedná se o multicentrickou longitudinální studii, jejímž primárním cílem je identifikovat nový vysoce rizikový neonatální profil pro rozvoj chronického onemocnění plic (CLD), počínaje perinatálním životem. Za účelem dosažení tohoto cíle provedou všechna zúčastněná oddělení přihlášeným matkám vaginální výtěr, odeberou placentu a pupečníkovou krev při porodu a periferní krev, tekutinu z bronchoalveolární laváže (BALF), mekonium a vzorky stolice všech zařazených novorozenců. Studie začne hodnocením prenatálních rizikových faktorů.

Po porodu budou placenty fixovány v 10% pufrovaném formalínu. Následně budou provedeny makroskopické a mikroskopické analýzy podle konsenzuálního prohlášení skupiny placentárních workshopů v Amsterdamu. Všem zapsaným ženám bude v době porodu odebrán vaginální výtěr. Pro analýzu miRNA, genetické variance a cytokinů budou odebrány 3 ml pupečníkové krve (tepny a/nebo žíly). Pouze u intubovaných kojenců se vzorek BALF získá nakapáním 1 ml/kg 0,9% chloridu sodného do endotracheální trubice a odsátím tekutiny do sterilního lapače hlenu. První vzorek BALF bude odebrán během prvních 24 hodin života, zatímco další vzorky BALF budou odebrány v 7 a 28 dnech života u novorozenců, kteří budou stále intubováni. První vzorek mekonia po narození a další vzorky stolice budou odebrány v 7, 28 dnech života, 6 a 12 měsících života. Vzorky vaginálních výtěrů, placenty, BALF, mekonia a stolice budou až do dalšího zpracování skladovány při -80 °C. U každého vzorku bude provedena extrakce bakteriální DNA na přísně kontrolovaném pracovišti biologické bezpečnosti úrovně 2 pomocí souprav DANAGENE MICROBIOME DNA (Danagen-Bioted) podle pokynů výrobce.

V pupečníkovém séru při narození (tepna) a po 48 hodinách života bude studováno 8–10 kandidátních miRNA, zejména miR-451, miR-29b a miR-16, protože se ukázalo, že mají inhibiční účinek na angiogeneze prostřednictvím suprese vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) a miR je spojena s genetickou náchylností k CLD. Model příčinné souvislosti s genetickou variací bude proveden u všech zařazených novorozenců ve 48 hodinách života (alespoň 500 μl plné krve) pomocí platformy MiSeq Illumina umožňující aplikaci technologií sekvenování nové generace.

K detekci variací protizánětlivých a prozánětlivých cytokinů korelujících se závažností onemocnění v průběhu času budou odebrány vzorky pupečníkové krve a periferní krve (2 ml do zkumavky EDTA) od zahrnutých kojenců při příjmu (do 48 hodin života). , v 7 a 28 dnech života, v 6 a 12 měsících. Budou zkoumány hladiny anti- (INF-y) i prozánětlivých (IL-6 a NGF) cytokinů. Všechny vzorky budou až do testování skladovány při -80 °C. Cytokiny budou měřeny pomocí komerčně dostupné soupravy ELISA podle pokynů výrobce.

Vyšetřovatelé se také pokusí prozkoumat souvislost mezi daty matky a placenty s analýzou novorozenců během prvních dnů života. Při příjmu novorozence na jednotku intenzivní péče o novorozence bude značná pozornost věnována zjišťování stupně a variací hemooxygenace a také přítomnosti infekce, která je původcem oxidativního stresu (OS) a onemocnění souvisejících s OS. Odeberou se následující vzorky: 1 ml periferní krve (do 48 hodin života). Další vzorky periferní krve budou odebrány v 7. a 28. dni života, v 6. a 12. měsíci života.

Oxidační stres (OS) a lipidové mediátory podílející se na OS budou hodnoceny jak biomarkery oxidativního poškození proteinů (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP), tak peroxidací lipidů (Isoprostany, IsoPs). Další hodnocení profilu oxidačního stresu bude provedeno měřením neenzymatických molekul antioxidantů (vitamín E; glutathion, GSH a kyselina askorbová, AA) a molekul enzymatických antioxidantů (superoxiddismutáza, SOD, kataláza, CAT a glutathionperoxidáza, GPx ). K tomuto účelu bude použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) a hmotnostní spektrometrie s rozhraním plynové chromatografie (GC-MS): HPLC k detekci vitaminu E, glutathionu, GSH a AA.

Posledním krokem bude prospektivní identifikace nového profilu vysoce rizikových novorozenců pro těžkou plicní dysfunkci v prvních 12 měsících života, s vyšším rizikem rozvoje astmatu a CHOPN v pozdějším věku. U všech zapsaných dětí bude proveden dlouhodobý výsledek, aby se odhalily vztahy mezi analýzou placenty, expresí miRNA, zánětem a mikrobiotou – jako součást in utero exposomu (chorioamnionitida nebo omezení růstu plodu) a oxidačním stresem se zánětem – jako součást postnatálního faktory (invazivní respirační podpora, Patent Ductus Arteriosus, pneumonie, sepse) – s plicním výsledkem ve smyslu abnormální plicní funkce v 6. a 12. měsíci věku.

Ve věku 6 a 12 měsíců budou kojenci podrobeni klinickému a plicnímu vyšetření. Test funkce plic (PFT) bude proveden u všech zařazených kojenců a bude zahrnovat analýzu dýchání Tidal a test vymývání dusíkem. Děti budou umístěny v poloze na zádech, během klidného, ​​přirozeného spánku, podle doporučení American Thoracic Society/European Respiratory Society s měřením plicních objemů, průtoku, funkční reziduální kapacity, Lung Clearence Index 5 % (LCI 5), Lung Clearence Index 2,5 % (LCI 2,5), poměr čas do vrcholu dechového výdechového průtoku/výdechový čas (tPTEF/tE). K vyloučení plicních abnormalit bude proveden ultrazvuk plic. Po umožnění přizpůsobení masce se zaznamená dechové dýchání, smyčky průtokového objemu po dobu >2 minut nebo >20 dechů bez artefaktů. PFT bude provedena za účelem srovnání funkčních respiračních dat s daty generovaného biochemického profilu. Budou studovány všechny možné vztahy mezi plicními funkcemi, biochemickými markery těsně před narozením a u kojenců ve věku 6-12 měsíců a antropometrickými měřeními. Plicní vývoj a funkce během mimoděložního života budou souviset s prenatálními měřeními. Budou porovnány údaje vhodné pro kojence v gestačním věku (AGA), malé děti pro gestační věk (SGA) a velké děti pro gestační věk (LGA).

Metody sběru dat Bude shromážděno několik typů dat, včetně kvantitativních, kvalitativních, získaných ze zobrazení, vzorků tkání a krve. Klinická data pro Cíl 1, 2 a 3 budou shromažďována a spravována pomocí elektronických nástrojů pro sběr dat REDCap hostovaných na UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Bude vyvinut speciální elektronický formulář pro hlášení případů (eCRF). Pseudoanonimizovaná data budou shromažďována od zúčastněných jednotek. Zkoušející bude odpovědný za to, že eCRF bude řádně a úplně vyplněn. Mezi zdroje klinických informací patří záznamy o pacientovi lékaře, záznamy z nemocnice, původní laboratorní záznamy, záznamy z lékárny, výsledky ultrazvukového vyšetření atd.

Statistický plán Primárním cílem studie je zjistit, zda klinické, demografické, laboratorní a další parametry jsou schopny předpovědět rozvoj chronického onemocnění plic ve 36. týdnu PMA a/nebo abnormální plicní funkce ve věku 12 měsíců. Za předpokladu přijatelné úrovně přesnosti s oblastí pod křivkou ROC alespoň 0,75 ± 0,15 je vyžadován vzorek o velikosti 42 pacientů.

Statistická analýza Vzorek bude popsán v jeho klinických a demografických charakteristikách pomocí vhodných indexů popisné statistiky. Do hloubky budou kvalitativní údaje vyjádřeny jako absolutní a relativní procentuální četnost, zatímco kvantitativní proměnné jako průměr a směrodatná odchylka (SD) nebo medián a mezikvartilní rozmezí (IQR), v závislosti na případu. Pro ověření Gaussova rozdělení kvantitativních proměnných bude použit Shapiro-Wilkův test. Rozdíly mezi skupinami ve výchozím stavu budou hodnoceny s ohledem na kvalitativní údaje buď Chí-kvadrát testem nebo Fisher-Freeman-Haltonsovým exaktním testem, podle potřeby. Kvantitativní data budou místo toho porovnána pomocí Studentova t testu pro nezávislé vzorky nebo Mann Withneyho neparametrického U testu, v závislosti na distribuci dat. Houslové grafy budou použity ke grafickému znázornění významných nebo klinicky relevantních rozdílů. Hodnocení rozdílu ve smyslu primárního výsledku po 12 měsících bude hodnoceno Kaplan-Meierovou analýzou přežití. Zejména bude použit log-rank test a budou nakresleny příslušné kumulativní křivky výskytu. Za účelem posouzení potenciálních prediktorů primárního výsledku po 12 měsících budou přizpůsobeny uni- a multivariabilní Coxovy regresní modely. Do hloubky budou potenciální prediktory výsledku vyhodnoceny pomocí běžných Coxových regresních modelů proporcionálního rizika a následně budou uvedeny poměry rizik (HR) a 95% intervaly spolehlivosti (CI). Proporcionalita rizikových funkcí bude vyhodnocena vizuální kontrolou rizik a Schoenfeldových reziduálních ploch. V případě pochybné proporcionality budou použity Coxově vážené regresní modely. Prediktory, které mají být zahrnuty do modelu s více proměnnými, budou vybrány na základě analýzy uniproměnných (p<0,05 nebo sugestivní, tj. 0,05 p <0,10) a expertního názoru v souladu s pravidlem alespoň 10 událostí podle výsledné proměnné a doporučení TRIPOD. Výkon modelu bude hodnocen několika indexy, jako je Cindex, Somersova Dxy-rank korelace, Nagelkerkeho hodnota R2, kalibrační průsečík a slop. C-index může být interpretován jako AUC, tj. míra přesnosti modelu. Statistická významnost je stanovena pro hodnoty p<0,05. Budou uvedeny také sugestivní hodnoty p (0,05, p < 0,10). Statistické analýzy budou provedeny pomocí STATA (StataCorp, USA) a R (https://www.r-project.org/).