Prevenzione della malattia polmonare cronica (CLD - Studio sulla prevenzione)

Background La malattia polmonare cronica (CLD) è una delle complicanze più comuni del danno polmonare perinatale e rappresenta una condizione sistemica con sequele a lungo termine, come disfunzione polmonare persistente, sintomi simili all'asma e BPCO. Il CLD riconosce molti fattori di rischio prenatale, tra cui il fumo materno, la corioamnionite e la restrizione della crescita intrauterina (IUGR), oltre a fattori di rischio postnatale come l'iperossia, la nutrizione parenterale, l'infiammazione e la ventilazione meccanica. L’esposizione all’infiammazione in utero altera lo sviluppo immunitario neonatale e predispone il polmone fetale a una risposta prolungata e disregolata alla ventilazione meccanica invasiva e all’ossigeno soprafisiologico. Le risposte alle influenze dannose (e protettive) nelle prime fasi della vita sono modulate da meccanismi genetici ed epigenetici, che potrebbero provocare cambiamenti strutturali permanenti con conseguenze significative nell’età adulta. Le gravidanze IUGR sono caratterizzate da un aumento dello stress ossidativo e i neonati IUGR sono ad alto rischio di malattie cardiovascolari, sindrome metabolica, disfunzione polmonare e malattie renali e respiratorie croniche in età adulta. Nonostante il costante aumento della conoscenza dei meccanismi che portano alla progressione del danno polmonare, quindi Finora non è stata sviluppata alcuna gestione efficace che possa portare alla prevenzione del CLD.

Obiettivi

1. identificare in modo prospettico potenziali biomarcatori in grado di predire il decorso grave della funzionalità polmonare nei primi 12 mesi di vita e realizzare un nuovo profilo per identificare precocemente i neonati ad alto rischio.
2. rilevare il modello di causalità della varianza genetica (mediante la piattaforma MiSeq Illumina) correlato a grave disfunzione polmonare e sviluppo di asma.
3. rilevare i MicroRNA e le variazioni delle citochine anti- e pro-infiammatorie (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) correlate alla gravità della disfunzione polmonare nei primi 12 mesi della vita e il rischio di sviluppare asma.

Disegno sperimentale Si tratta di uno studio longitudinale multicentrico, il cui obiettivo primario è identificare un nuovo profilo neonatale ad alto rischio per lo sviluppo di malattia polmonare cronica (CLD), a partire dalla vita perinatale. Per raggiungere questo obiettivo tutte le Unità partecipanti eseguiranno un tampone vaginale alle madri arruolate, raccoglieranno sangue placentare e cordonale alla nascita e campioni di sangue periferico, liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF), meconio e feci di tutti i neonati arruolati. Lo studio inizierà con la valutazione dei fattori di rischio prenatale.

Dopo il parto le placente verranno fissate in formalina tamponata al 10%. Successivamente verranno eseguite analisi macroscopiche e microscopiche secondo la dichiarazione di consenso del gruppo di workshop sulla placenta di Amsterdam. Al momento del parto verrà raccolto un tampone vaginale per tutte le donne iscritte. Verranno prelevati 3 ml di sangue cordonale (arteria e/o vena) per l'analisi di miRNA, varianza genetica e citochine. Solo nei neonati intubati, il campione BALF sarà ottenuto instillando 1 ml/kg di cloruro di sodio allo 0,9% nel tubo endotracheale e aspirando il fluido in una trappola sterile per muco. Il primo campione BALF verrà raccolto entro le prime 24 ore di vita, mentre ulteriori campioni BALF verranno raccolti a 7 e 28 giorni di vita nei neonati che saranno ancora intubati. Il primo campione di meconio dopo la nascita e ulteriori campioni di feci verranno raccolti a 7, 28 giorni di vita, 6 e 12 mesi di vita. I campioni di tamponi vaginali, placenta, BALF, meconio e feci verranno conservati a -80°C fino al successivo trattamento. Per ciascun campione, l'estrazione del DNA batterico verrà eseguita in un luogo di lavoro di sicurezza biologica di livello 2 rigorosamente controllato utilizzando i kit DANAGENE MICROBIOME DNA (Danagen-Bioted) secondo le istruzioni del produttore.

Nel siero cordonale alla nascita (arteria) e a 48 ore di vita verranno studiati 8-10 miRNA candidati, in particolare miR-451, miR-29b e miR-16 poiché è stato dimostrato che hanno un effetto inibitorio sulla l'angiogenesi attraverso la soppressione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e il miR è associata alla suscettibilità genetica al CLD. Il modello di causalità della varianza genetica sarà eseguito in tutti i neonati arruolati a 48 ore di vita (almeno 500 μL di sangue intero) utilizzando una piattaforma MiSeq Illumina che consente l'applicazione delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione.

Per rilevare variazioni di citochine anti- e pro-infiammatorie correlate alla gravità della malattia nel tempo, verranno prelevati campioni di sangue cordonale e periferico (2 ml in una provetta EDTA) dai neonati inclusi al momento del ricovero (entro 48 ore di vita) , a 7 e 28 giorni di vita, a 6 e 12 mesi. Verranno studiati i livelli di citochine sia anti-(INF-y) che pro-infiammatorie (IL-6 e NGF). Tutti i campioni verranno conservati a -80 °C fino al momento del test. Le citochine saranno misurate con un kit ELISA disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.

I ricercatori cercheranno anche di esplorare l'associazione tra i dati della madre e della placenta con l'analisi dei neonati durante i primi giorni di vita. Al momento del ricovero del neonato nell'Unità di Terapia Intensiva Neonatale, notevole attenzione sarà posta nell'accertare il grado e le variazioni dell'emossigenazione, nonché la presenza di infezioni che sono all'origine dello Stress Ossidativo (OS) e delle patologie ad esso correlate. Verranno raccolti i seguenti campioni: 1 ml di sangue periferico (entro 48 ore di vita). Ulteriori campioni di sangue periferico verranno raccolti a 7 e 28 giorni di vita, a 6 e 12 mesi di vita.

Lo stress ossidativo (OS) e i mediatori lipidici coinvolti nell'OS saranno valutati sia mediante biomarcatori del danno ossidativo proteico (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) che della perossidazione lipidica (Isoprostani, IsoPs). Un'ulteriore valutazione del profilo di stress ossidativo sarà effettuata misurando le molecole antiossidanti non enzimatiche (vitamina E; glutatione, GSH e acido ascorbico, AA) e le molecole antiossidanti enzimatiche (superossido dismutasi, SOD, catalasi, CAT e glutatione perossidasi, GPx ). A tal fine verranno utilizzate la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e la spettrometria di massa interfacciata con gascromatografia (GC-MS): HPLC per rilevare vitamina E, glutatione, GSH e AA.

Il passo finale sarà identificare in modo prospettico un nuovo profilo di neonati ad alto rischio di disfunzione polmonare grave nei primi 12 mesi di vita, a rischio più elevato di sviluppare asma e BPCO in età avanzata. Verrà eseguito un risultato a lungo termine di tutti i bambini arruolati per svelare le relazioni tra analisi della placenta, espressione di miRNA, infiammazione e microbiota - come parte dell'esposizione in utero (corioamnionite o restrizione della crescita fetale) e stress ossidativo con infiammazione - come parte del processo postnatale. fattori (supporto respiratorio invasivo, dotto arterioso pervio, polmonite, sepsi) - con l'esito polmonare in termini di funzionalità polmonare anormale a 6 e 12 mesi di età.

A 6 e 12 mesi di età, i bambini riceveranno una valutazione clinica e polmonare. Il test di funzionalità polmonare (PFT) sarà eseguito in tutti i neonati arruolati e includerà l'analisi della respirazione corrente e il test di washout dell'azoto. I neonati verranno posti in posizione supina, durante un sonno tranquillo e naturale, secondo le raccomandazioni dell'American Thoracic Society/European Respiratory Society con misurazione dei volumi polmonari, del flusso, della capacità funzionale residua, Lung Clearence Index 5% (LCI 5), Lung Clearence Indice 2,5% (LCI 2,5), rapporto tempo-picco del flusso espiratorio corrente/tempo espiratorio (tPTEF/tE). Verrà eseguita un'ecografia polmonare per escludere anomalie polmonari. Dopo aver consentito l'adattamento alla maschera, verranno registrati la respirazione corrente, i cicli flusso-volume per >2 minuti o >20 respiri senza artefatti. Verrà effettuata una PFT per mettere in relazione i dati respiratori funzionali con quelli del profilo biochimico generato. Verranno studiate eventuali relazioni tra la funzione polmonare, i marcatori biochimici appena prima della nascita e nei neonati a 6-12 mesi di età e le misurazioni antropometriche. Lo sviluppo e la funzione polmonare durante la vita extrauterina saranno correlati con misurazioni prenatali. Verranno confrontati i dati relativi ai neonati appropriati per l'età gestazionale (AGA), ai neonati piccoli per l'età gestazionale (SGA) e ai neonati grandi per l'età gestazionale (LGA).

Metodi di raccolta dei dati Verranno raccolti diversi tipi di dati, inclusi quelli quantitativi, qualitativi, generati da imaging, campioni di tessuto e sangue. I dati clinici per gli Obiettivi 1, 2 e 3 saranno raccolti e gestiti utilizzando gli strumenti elettronici di acquisizione dati REDCap ospitati presso UO1- Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Verrà sviluppato un modulo elettronico dedicato per la segnalazione dei casi (eCRF). I dati pseudo-anonimizzati saranno raccolti dalle unità coinvolte. Lo sperimentatore sarà responsabile di garantire che la eCRF sia correttamente e completamente compilata. Le fonti di informazioni cliniche includono la cartella clinica del medico, le note ospedaliere, i dati originali di laboratorio, i dati della farmacia, i risultati degli esami ecografici, ecc.

Piano statistico L'endpoint primario dello studio è identificare se i parametri clinici, demografici, di laboratorio e altri sono in grado di predire lo sviluppo di malattia polmonare cronica a 36 settimane di PMA e/o di funzionalità polmonare anormale a 12 mesi di età. Supponendo un livello di accuratezza accettabile, con un'area sotto la curva ROC di almeno 0,75 ± 0,15, è necessaria una dimensione del campione di 42 pazienti.

Analisi statistica Il campione verrà descritto nelle sue caratteristiche cliniche e demografiche utilizzando gli opportuni indici statistici descrittivi. In modo approfondito, i dati qualitativi saranno espressi come frequenza percentuale assoluta e relativa, mentre le variabili quantitative come media e deviazione standard (SD) o mediana e intervallo interquartile (IQR), a seconda del caso. Per verificare la distribuzione gaussiana delle variabili quantitative verrà applicato il test di Shapiro-Wilk. Le differenze tra i gruppi al basale saranno valutate, per quanto riguarda i dati qualitativi, mediante il test del Chi-quadrato o il test esatto di Fisher-Freeman-Haltons, a seconda dei casi. I dati quantitativi verranno invece confrontati utilizzando il test t di Student per campioni indipendenti o il test U non parametrico di Mann Withney, a seconda della distribuzione dei dati. I grafici di violino verranno utilizzati per rappresentare graficamente differenze significative o clinicamente rilevanti. La valutazione della differenza in termini di esito primario a 12 mesi sarà valutata mediante analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier. In particolare, verrà applicato il log-rank test e verranno disegnate opportune curve di incidenza cumulativa. Al fine di valutare i potenziali predittori dell'esito primario a 12 mesi, verranno adattati modelli di regressione di Cox uni e multivariabili. In modo approfondito, i potenziali predittori dell'esito saranno valutati mediante normali modelli di regressione di Cox a rischio proporzionale, e di conseguenza verranno riportati gli Hazard Ratio (HR) e gli intervalli di confidenza (IC) al 95%. La proporzionalità delle funzioni di rischio sarà valutata mediante ispezione visiva dei pericoli e dei grafici residui di Schoenfeld. In caso di dubbia proporzionalità, verranno adattati modelli di regressione ponderata di Cox. I predittori da includere nel modello multivariabile saranno selezionati sulla base dell'analisi univariabile (p <0,05 o suggestiva, ovvero 0,05 p <0,10) e dell'opinione degli esperti, coerente con la regola di almeno 10 eventi per variabile di risultato, e le raccomandazioni TRIPOD. Le prestazioni del modello saranno valutate da diversi indici, come Cindex, correlazione Dxy-rank di Somers, valore R2 di Nagelkerke, intercetta di calibrazione e slop. L'indice C può essere interpretato come un AUC, ovvero una misura dell'accuratezza del modello. La significatività statistica è impostata per valori di p<0,05. Verranno riportati anche valori p suggestivi (0,05, p < 0,10). Le analisi statistiche saranno condotte utilizzando STATA (StataCorp, USA) e R (https://www.r-project.org/).