Prevención de la enfermedad pulmonar crónica (CLD - Estudio de prevención)

Antecedentes La enfermedad pulmonar crónica (EPC) es una de las complicaciones más comunes de la lesión pulmonar perinatal que representa una condición sistémica con secuelas a largo plazo, como disfunción pulmonar persistente, síntomas similares al asma y BPCO. La EPC reconoce muchos factores de riesgo prenatales, incluido el tabaquismo materno, la corioamnionitis y la restricción del crecimiento intrauterino (RCIU), además de factores de riesgo posnatales como la hiperoxia, la nutrición parenteral, la inflamación y la ventilación mecánica. La exposición a la inflamación en el útero altera el desarrollo inmunológico neonatal y predispone al pulmón fetal a una respuesta prolongada desregulada a la ventilación mecánica invasiva y al oxígeno suprafisiológico. Las respuestas a influencias nocivas (y protectoras) en las primeras etapas de la vida están moduladas por mecanismos genéticos y epigenéticos, que podrían dar lugar a cambios estructurales permanentes con consecuencias significativas en la edad adulta. Los embarazos con RCIU se caracterizan por un aumento del estrés oxidativo y los bebés con RCIU tienen un alto riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, síndrome metabólico, disfunción pulmonar y enfermedades renales y respiratorias crónicas en la edad adulta. A pesar del constante aumento del conocimiento sobre los mecanismos que conducen a la progresión del daño pulmonar, por lo que Hasta el momento, no se ha desarrollado ningún tratamiento eficaz que conduzca a la prevención de la EPC.

Objetivos

1. identificar prospectivamente biomarcadores potenciales capaces de predecir el curso grave de la función pulmonar en los primeros 12 meses de vida y realizar un nuevo perfil para identificar tempranamente a los recién nacidos de alto riesgo.
2. detectar el modelo de causalidad de la variación genética (mediante la plataforma MiSeq Illumina) que se correlaciona con la disfunción pulmonar grave y el desarrollo de asma.
3. detectar microARN, así como variaciones de citoquinas antiinflamatorias y proinflamatorias (MIP-1a, MCP-1, IL-8, TNF-a, IFN-g, IL-10) que se correlacionan con la gravedad de la disfunción pulmonar en los primeros 12 meses. de vida y el riesgo de desarrollar asma.

Diseño experimental Se trata de un estudio longitudinal multicéntrico, cuyo objetivo principal es identificar un nuevo perfil neonatal de alto riesgo para el desarrollo de enfermedad pulmonar crónica (EPC), a partir de la vida perinatal. Para alcanzar este objetivo, todas las Unidades participantes realizarán hisopos vaginales a las madres inscritas, recolectarán sangre de placenta y cordón umbilical al nacer y muestras de sangre periférica, líquido de lavado broncoalveolar (BALF), meconio y heces de todos los recién nacidos inscritos. El estudio comenzará con la evaluación de los factores de riesgo prenatal.

Después del parto, las placentas se fijarán en formalina tamponada al 10%. Posteriormente se realizarán análisis macroscópicos y microscópicos de acuerdo con la declaración de consenso del grupo del taller placentario de Ámsterdam. Se recolectará un hisopo vaginal en el momento del parto de todas las mujeres inscritas. Se extraerán tres ml de sangre del cordón umbilical (arteria y/o vena) para el análisis de miARN, varianza genética y citocinas. Sólo en bebés intubados, la muestra BALF se obtendrá instilando 1 ml/kg de cloruro de sodio al 0,9% en el tubo endotraqueal y succionando el líquido en una trampa de moco estéril. La primera muestra de BALF se recolectará dentro de las primeras 24 h de vida, mientras que se recolectarán más muestras de BALF a los 7 y 28 días de vida en los recién nacidos que aún estarán intubados. La primera muestra de meconio después del nacimiento y se recolectarán muestras adicionales de heces a los 7, 28 días de vida, 6 y 12 meses de vida. Las muestras de hisopos vaginales, placenta, BALF, meconio y heces se almacenarán a -80 ° C hasta su posterior procesamiento. Para cada muestra, la extracción de ADN bacteriano se realizará en un lugar de trabajo de seguridad biológica de nivel 2 estrictamente controlado utilizando kits de ADN DANAGENE MICROBIOME (Danagen-Bioted) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En el suero del cordón umbilical al nacer (arteria) y a las 48 horas de vida, se estudiarán entre 8 y 10 miARN candidatos, en particular miR-451, miR-29b y miR-16, ya que se ha demostrado que tienen un efecto inhibidor sobre La angiogénesis a través de la supresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y miR se asocia con la susceptibilidad genética a la EPC. El modelo de causalidad de la variación genética se realizará en todos los recién nacidos inscritos a las 48 horas de vida (al menos 500 μL de sangre total) utilizando una plataforma MiSeq Illumina que permite la aplicación de tecnologías de secuenciación de próxima generación.

Para detectar variaciones de citocinas antiinflamatorias y proinflamatorias que se correlacionen con la gravedad de la enfermedad a lo largo del tiempo, se obtendrán muestras de sangre del cordón umbilical y de sangre periférica (2 ml en un tubo con EDTA) de los bebés incluidos en el momento del ingreso (dentro de las 48 horas de vida) , a los 7 y 28 días de vida, a los 6 y 12 meses. Se investigarán los niveles de citocinas anti (INF-y) y proinflamatorias (IL-6 y NGF). Todas las muestras se almacenarán a -80 °C hasta el momento de la prueba. Las citocinas se medirán con un kit ELISA disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante.

Los investigadores también intentarán explorar la asociación entre los datos de la madre y la placenta con el análisis de los recién nacidos durante los primeros días de vida. Al ingreso del recién nacido a la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales, se prestará considerable atención a conocer el grado y las variaciones en la hemooxigenación, así como la presencia de infección que esté en el origen del Estrés Oxidativo (OS) y las enfermedades relacionadas con el OS. Se recolectarán las siguientes muestras: 1 ml de sangre periférica (dentro de las 48 horas de vida). Se recolectarán muestras de sangre periférica adicionales a los 7 y 28 días de vida, a los 6 y 12 meses de vida.

El estrés oxidativo (OS) y los mediadores lipídicos implicados en el OS se evaluarán tanto mediante biomarcadores de daño proteico oxidativo (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP) como de peroxidación lipídica (isoprostanos, IsoP). Se realizará una evaluación adicional del perfil de estrés oxidativo midiendo moléculas antioxidantes no enzimáticas (vitamina E; glutatión, GSH y ácido ascórbico, AA) y moléculas antioxidantes enzimáticas (superóxido dismutasa, SOD, catalasa, CAT y glutatión peroxidasa, GPx ). Para ello se empleará cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectrometría de masas interconectada con cromatografía de gases (GC-MS): HPLC para detectar vitamina E, glutatión, GSH y AA.

El paso final será identificar prospectivamente un nuevo perfil de recién nacidos de alto riesgo de sufrir disfunción pulmonar grave en los primeros 12 meses de vida, con mayor riesgo de desarrollar asma y EPOC en edades posteriores. Se realizará un resultado a largo plazo de todos los bebés inscritos para desentrañar las relaciones entre el análisis de la placenta, la expresión de miARN, la inflamación y la microbiota, como parte del exposoma en el útero (corioamnionitis o restricción del crecimiento fetal) y el estrés oxidativo con inflamación, como parte del tratamiento posnatal. factores (soporte respiratorio invasivo, conducto arterioso permeable, neumonía, sepsis) - con el resultado pulmonar en términos de función pulmonar anormal a los 6 y 12 meses de edad.

A los 6 y 12 meses de edad, los bebés recibirán evaluación clínica y pulmonar. Se realizará una prueba de función pulmonar (PFT) en todos los bebés inscritos e incluirá análisis de respiración tidal y prueba de lavado de nitrógeno. Los bebés serán colocados en posición supina, durante un sueño tranquilo y natural, de acuerdo con las recomendaciones de la Sociedad Torácica Americana/Sociedad Respiratoria Europea con medición de volúmenes pulmonares, flujo, capacidad residual funcional, índice de aclaramiento pulmonar del 5% (LCI 5), aclaramiento pulmonar. Índice 2,5% (LCI 2,5), relación tiempo hasta el flujo espiratorio corriente máximo/tiempo espiratorio (tPTEF/tE). Se realizará una ecografía pulmonar para descartar anomalías pulmonares. Después de permitir la adaptación a la mascarilla, se registrarán la respiración corriente, los bucles de volumen de flujo durante >2 minutos o >20 respiraciones libres de artefactos. Se realizará PFT para relacionar los datos respiratorios funcionales con los del perfil bioquímico generado. Cualquier posible relación entre la función pulmonar, los marcadores bioquímicos justo antes del nacimiento y en los bebés de 6 a 12 meses de edad, y Se estudiarán las medidas antropométricas. El desarrollo y función pulmonar durante la vida extrauterina estarán relacionados con las mediciones prenatales. Se compararán los datos de bebés apropiados para la edad gestacional (AGA), pequeños para la edad gestacional (PEG) y grandes para la edad gestacional (LGA).

Métodos de recopilación de datos Se recopilarán varios tipos de datos, incluidos cuantitativos, cualitativos, generados a partir de imágenes, muestras de tejido y sangre. Los datos clínicos para los Objetivos 1, 2 y 3 se recopilarán y gestionarán utilizando las herramientas de captura de datos electrónicos REDCap alojadas en UO1-Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli-IRCCS (https://redcap-irccs.policlinicogemelli.it/).

Se desarrollará un formulario electrónico de notificación de casos (eCRF). Se recopilarán datos pseudoanonimizados de las unidades involucradas. El investigador será responsable de garantizar que el eCRF se complete de manera adecuada y completa. Las fuentes de información clínica incluyen el registro médico del paciente, notas del hospital, registros de laboratorio originales, registros de farmacia, resultados de exámenes de ultrasonido, etc.

Plan estadístico El criterio de valoración principal del estudio es identificar si los parámetros clínicos, demográficos, de laboratorio y otros son capaces de predecir el desarrollo de enfermedad pulmonar crónica a las 36 semanas de PMA y/o de función pulmonar anormal a los 12 meses de edad. Suponiendo un nivel de precisión aceptable, con un área bajo la curva ROC de al menos 0,75 ± 0,15, se requiere un tamaño de muestra de 42 pacientes.

Análisis estadístico La muestra se describirá en sus características clínicas y demográficas utilizando los índices estadísticos descriptivos adecuados. En profundidad, los datos cualitativos se expresarán como frecuencia porcentual absoluta y relativa, mientras que las variables cuantitativas como media y desviación estándar (DE) o mediana y rango intercuartil (RIC), según el caso. Para verificar la distribución gaussiana de variables cuantitativas se aplicará la prueba de Shapiro-Wilk. Las diferencias entre los grupos al inicio del estudio se evaluarán, con respecto a los datos cualitativos, mediante la prueba de Chi cuadrado o la prueba exacta de Fisher-Freeman-Haltons, según corresponda. En cambio, los datos cuantitativos se compararán mediante la prueba t de Student para muestras independientes o la prueba U no paramétrica de Mann Withney, según la distribución de los datos. Se utilizarán gráficos de violín para representar gráficamente diferencias significativas o clínicamente relevantes. La evaluación de la diferencia en términos de resultado primario a los 12 meses se evaluará mediante análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. En particular, se aplicará la prueba de rangos logarítmicos y se trazarán curvas de incidencia acumulativa apropiadas. Para evaluar posibles predictores del resultado primario a los 12 meses, se ajustarán modelos de regresión de Cox uni y multivariables. En profundidad, los posibles predictores del resultado se evaluarán mediante modelos de regresión de Cox de riesgo proporcional ordinario y, en consecuencia, se informarán los Hazard Ratios (HR) y los intervalos de confianza (IC) del 95%. La proporcionalidad de las funciones de peligro se evaluará mediante inspección visual de los peligros y las gráficas residuales de Schoenfeld. En caso de dudosa proporcionalidad, se ajustarán modelos de regresión ponderados de Cox. Los predictores que se incluirán en el modelo multivariable se seleccionarán con base en el análisis univariable (p<0,05 o sugestivo, es decir, 0,05 p <0,10) y la opinión de expertos, de acuerdo con la regla de al menos 10 eventos por variable de resultado y las recomendaciones del TRIPOD. El rendimiento del modelo se evaluará mediante varios índices, como Cindex, correlación de rango Somers Dxy, valor R2 de Nagelkerke, intersección de calibración y pendiente. El índice C se puede interpretar como un AUC, es decir, una medida de la precisión del modelo. La significación estadística se establece para valores de p<0,05. También se informarán valores de p sugeridos (0,05, p <0,10). Los análisis estadísticos se realizarán utilizando STATA (StataCorp, EE. UU.) y R (https://www.r-project.org/).